QuEChERS-高效液相色谱法测定饲料中牛至香酚新方法的研究

贺习文 李 宏 赵彩会 高勤叶 黄姣姣 李易轩 王 珊 石 巍

（1.陕西秦云农产品检验检测有限公司，陕西渭南714000；2.河北省霸州市农业农村局，河北霸州065700）

牛至香酚是从牛至中提取的一类挥发性油，是一种抗菌、抗氧化和防腐功能的新型绿色添加剂。牛至香酚对畜禽动物肠道细菌引起的腹泻能起到有效的抑制作用，能够增强动物免疫力，促进动物生长，提高动物生产性能，具有防腐、驱虫、杀菌的作用[1-3]。且在动物体内无残留，可长期在日粮中添加使用[4-5]。

牛至香酚是由多种物质混合而成的添加剂，其主要成分为香芹酚和百里香酚，香芹酚和百里香酚属于同分异构体，香芹酚中的-OH 基团在甲基邻位，而百里香酚的-OH 在甲基的间位，两者的化学性质相似。图1、图2为香芹酚和百里香酚化学结构式。

农业部《饲料添加剂品种目录（2013）》中把牛至香酚归位其他类，适用范围为猪和家禽，规定了食用香料在养殖业的使用，其中香芹酚和百里香酚是应用最为广泛的两种香料，在配合饲料中添加量为5～10 mg/kg。农业农村部公布关于2018～2021年开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作的通知，明确了养殖业减抗和限抗的时间表。香芹酚等绿色添加剂在饲料行业优势逐渐明显，应用也越来越广泛，本文可满足饲料中香芹酚和百里香酚组分的监控需要[6-7]。

图1 香芹酚化学结构式

图2 百里香酚化学结构式

目前有关测定香芹酚和百里香酚含量的报道较少，其中较为典型的有董茂峰等[6]利用气相色谱法测定饲料中香芹酚和百里香酚的含量，任玉琴等[8]利用高效液相色谱法测定饲料中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，但未对全部饲料品种进行试验，且样品没有净化；窦茂鑫等[9]发表利用高效液相色谱法测定了牛至油添加剂中的香芹酚和百里香酚的含量的检测方法。

有关文献及资料表明，检测香芹酚和牛至香酚含量的主要方法有气相色谱法[10-12]等，高效液相色谱法比较少见。本文建立了QuEChERS-高效液相色谱法测定饲料中香芹酚和百里香酚的含量，是一种新型实用的检测方法。

1 仪器、试剂及方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪：UltiMate 3000；十万分之一天平：MS205DU；万分之一天平：CP224C；离心机：H1850；涡轮混合器：XW-80A；超声波提取仪：KQ-100DB。

1.2 试剂

香芹酚标准品含量99.10%；百里香酚标准品含量99.23%；乙腈：色谱纯；无水乙醇：优级纯；冰乙酸：优级纯；C18吸附材料；硅酸镁吸附材料；中性氧化铝吸附材料；一级水。

1.3 标准贮备液的配制

香芹酚标准贮备液：准确称取香芹酚标准品0.010 03 g 于10 ml 容量瓶中，用无水乙醇溶解至刻度，浓度为993.97 μg/ml。

百里香酚标准贮备液：准确称取百里香酚标准品0.012 59 g 于10 ml 容量瓶中，用无水乙醇溶解至刻度，浓度为1 249.3 μg/ml。

混合标准中间液：准确移取上述香芹酚标准贮备1.0 ml和百里香酚标准贮备液0.8 ml于10 ml棕色容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀，浓度为100 μg/ml。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备取饲料样品按四分法缩分，直至混合均匀，取其中约100 g样品，用粉碎机粉碎，全部通过60目筛。

1.4.2 样品前处理

称取粉碎后的配合饲料、浓缩饲料、精料补充料10 g，复合预混料、维生素预混料样品5 g（精确至0.000 1 g），置于100 ml棕色容量瓶中，加入50%乙腈水溶液70 ml，在超声波提取仪上超声提取20 min，取出放置冷却至室温，用50%乙腈水溶液定容至刻度，混匀。

1.4.3 提取液的净化

维生素预混料的提取液通过0.45 μm 有机滤膜后直接上机测定，配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和复合预混料样品提取液在4 000 r/min 离心5 min，取上清液5.0 ml 于10 ml 离心管中，加入0.1 g C18 吸附材料和0.1 g 硅酸镁吸附材料，涡轮混合1 min，静置片刻，取上清液过0.45 μm 有机滤膜后直接上机测定。

1.4.4 色谱条件

流动相：吸取10 ml冰乙酸于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，取此溶液500 ml 与500 ml乙腈混匀；色谱柱：Hypersil GOLDTMC18(250×4.6 mm，5 μm)；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

准确吸取1.3 中的混合标准中间液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ml于100 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml，以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，相关系数（r2）达到0.999 9，证明标准曲线线性良好。

2.2 流动相的优化

香芹酚和百里香酚易溶于醇类等有机试剂，不溶于水，因此选择流动相时优先考虑有机试剂，使用甲醇作为有机相时，由于甲醇在低波长有较大吸收，出现溶剂峰干扰，峰型较差且干扰目标峰，当有机相使用乙腈时，溶剂峰消失，因此有机相选择乙腈，在有机相和水相比例上，优先考虑较大的有机相比例，将乙腈的比例从90%逐渐降低，结果发现当乙腈比例为50%时，目标峰出峰时间和分离效果均达到要求，因此比例确定为50%乙腈+50%水相（v+v），水相使用纯水时，目标峰出现拖尾现象，向水相中加入少量冰乙酸，拖尾峰有改善。测试不同比例的酸，结果表明，酸浓度为1%时效果最佳。

2.3 检测波长的确定

使用二极管阵列检测器（DAD）对香芹酚和百里香酚标准溶液进行紫外光谱扫描，扫描结果如图3、图4。

图3 香芹酚紫外光谱图

从图3 和图4 可以看出，香芹酚的最大吸收波长为194.02、214.66 nm 和274.67 nm，百里香酚的最大吸收波长为193.97、215.56 nm 和275.59 nm，使用194、215 nm 和275 nm 进行测定时，发现194 nm 和215 nm溶剂峰很多，基线漂移程度较大，而275 nm处没有溶剂峰干扰，且基线稳定。因此确定检测波长为275 nm。

2.4 柱温的确定

图4 百里香酚紫外光谱图

试验选取了25～45 ℃一共5 个温度点的测试（每隔5 ℃测试一次），25 ℃时色谱峰的分离效果最佳，但目标峰峰宽较大，且百里香酚峰型有拖尾现象；30 ℃时两峰完全分离，峰宽合理，百里香酚没有拖尾现象，35 ℃及以上峰型窄，目标峰尖锐，但两种化合物无法达到完全分离，最终确定柱温为30 ℃。最终条件下的标准图谱和样品加标图谱见图5、图6。

2.5 加标回收及精密度

试验选取了五种不同类型的饲料产品，分别进行加标回收试验和精密度测定，所得结果见表1。

从表1可以看出，五种不同类型的样品加标回收率均大于92%，回收率良好，相对标准偏差RSD 小于5%，满足试验要求。

2.6 检出限及定量限

试验以3 倍S/N 值为检出限，10 倍S/N 值为定量限，在五种不同类型的饲料中进行加标试验，通过逐渐降低加标浓度，当添加浓度为0.08 mg/kg 时，峰值基本为3倍S/N值，为了减小试验误差，将检出限定为0.1 mg/kg，定量限定为0.3 mg/kg。通过对最小检出限进行加标试验，五种不同类型的饲料中添加回收率均在92%以上，结果可满足要求。

2.7 净化材料的选择

试验过程中发现基质较为复杂的样品杂峰较多，因此考虑使用净化材料进行净化吸附，以此来达到更加稳定的试验效果，试验以同组加标样品进行对比，空白组为加标样品未经净化直接测定，对照组分别为加入0.1 g C18、0.1 g C18+0.1 g 硅酸镁、0.1 g C18+0.1 g 硅酸镁+0.1 g 中性氧化铝，所得的试验结果见图7。

图5 标准溶液谱图

图6 加标样品谱图

表1 加标回收率及精密度RSD（%，n=6）

图7 样品溶液净化结果比较

从图7 可以看出，只加入C18 作为净化材料的样品净化效果不明显，只去除掉了小部分杂质，而加入了C18和硅酸镁的样品则净化效果比较明显，前面的杂峰明显减少，且目标峰处的基线稳定，而添加了C18、硅酸镁和中性氧化铝的样品净化效果和第二组无太大变化，而且在百里香酚目标峰后出现了基线上浮，综合考虑，选择C18 和硅酸镁作为净化材料效果最好。

3 结论

试验证明，QuEChERS-高效液相色谱法测定饲料中香芹酚和百里香酚的含量数据可靠，回收率高且稳定，检出限和定量限低，能够满足大部分饲料产品的检测，同时通过QuEChERS 技术的净化[13]，使得样品溶液更加纯净，在检测过程中减少了杂峰的干扰，且不影响目标物的定性和定量，是一种新的思路，此方法操作简单，结果准确，可以为饲料中香芹酚和百里香酚的测定提供数据参考。