基于海藻酸钠的复合壁材包被嗜酸乳杆菌及其效果评估

杨新建 朱建晨 田 璐 王伟青 李凌燕

（北京农业职业学院，北京102442）

乳酸菌作为一种益生菌，其在维持动物消化道菌群平衡[1]、促进动物生长生产性能[2]、增强动物免疫功能[3]、改善动物机体体质[4]以及缓解不良应激[5]等方面的益生功能，已被多项研究所证实。但是乳酸菌多为厌氧菌或兼性厌氧菌，耐受胃酸、胆汁酸的能力差，抵抗外界温度、湿度、O2和压力等不良条件的能力不足，同时非同源乳酸菌还存在不易定植等缺点，致使到达肠道的乳酸菌很难达到发挥其益生作用的数量要求（107cfu/ml）[6]。

针对上述问题，将乳酸菌微胶囊化是保护其活性和数量，发挥其益生作用的较为有效的方式。而海藻酸钠由于其便宜、易于处理、无毒、温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性、易于在肠道破裂、形成的微囊直径小（1～3 μm）等优点[7]，适于作为包被药物、蛋白或细胞的微胶囊壁材。但是，在低酸环境下，由于海藻酸钠对酸敏感，其完整性易受离子和螯合剂的影响，并且形成的胶囊多孔，使其对包被的益生菌的保护作用受到严重制约。因此，研究人员利各种强化手段来提高海藻酸钠微胶囊的保护效果。

将海藻酸钠和其它多聚物混合后对益生菌进行包埋是解决单独海藻酸钠包被所存在问题的首选方式[8]。这些多聚物多以多糖类的碳水化合物形式存在，与海藻酸钠复合后，不但可通过填充海藻酸钠微胶囊存在的孔径提高对益生菌的保护作用，还可以帮助一些微量元素和代谢物进入微胶囊，促进微胶囊内益生菌的存活[9]；另外，这些物质还可作为益生元存在提高微胶囊内的益生菌。

本研究通过前期试验，确定成膜性能较佳的瓜尔豆胶与海藻酸钠组成复合壁材，对目标菌嗜酸乳杆菌进行包被处理。通过检测其包被效率、粒径大小、耐酸性、耐胆盐以及肠道释放等特性，评估微胶囊对目标菌的保护性能，以期制备一种新型高效的微胶囊材料，为复合壁材微胶囊技术的应用提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜酸乳杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司；海藻酸钠、瓜尔豆胶购至上海源叶生物科技有限公司；胰酶粉（4 活性单位/mg）、胃蛋白酶（≥250 活性单位/mg）购自Sigma（上海）。CaCl2（分析纯）、NaCl（分析纯）、NaOH（分析纯）；KH2PO4（分析纯）、磷酸缓冲液（PBS）、吐温-80、猪胆盐和盐酸，购自国药集团化学试剂有限公司；鲁花大豆油，购自山东鲁花集团有限公司。

主要实验设备见表1。

表1 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 海藻酸钠与瓜尔豆胶复合壁材对目标菌的包被

1.2.1.1 目标菌悬浮液的制备

嗜酸乳杆菌：冻存的甘油管室温溶化后分区划线接种于MRS 固体培养基，37 ℃培养24 h，然后挑取单菌落，接种于50 ml 三角瓶（装液50 ml），37 ℃静置培养12 h 左右，测定其OD600，再次接种于50 ml三角瓶（装液50 ml MRS 肉汤，接种量根据“取样体积×OD600=50×0.1”计算而得，也即是接种后使原液OD600为0.1），37 ℃静止培养12 h（1×109CFU/ml 左右），然后8 500×g、4 ℃条件下离心10 min，菌泥重悬后终浓度为3×1010CFU/ml左右。

1.2.1.2 复合壁材与目标菌相容性

分别在MRS 肉汤培养基中加入2.5%海藻酸钠、2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶，然后取等量目标菌培养液接种到各混合液中，相应条件下（37 ℃厌氧或静置）培养24 h，涂布MRS 琼脂平板进行活菌计数，以考察芯壁材的生物相容性。同时，在不含壁材的MRS肉汤培养基中接种相同数量菌液，同等条件下培养作对照。

1.2.1.3 组合壁材对目标菌的包被

采用2.5%海藻酸钠、2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶（w/v）分别作为壁材，100 ml，灭菌后，冷却至38～40 ℃，与目标菌菌泥（2 ml）混合，搅拌均匀后，加入到300 ml大豆油中（含有0.5%吐温-80 (w/v)），高速搅拌20～30 min（磁力搅拌器最高转速），直到完全乳化（2 000 r/min，10 min不分层)，然后沿器壁快速(20 ml/s)加入100 ml 0.1 mol/l 的CaCl2溶液，低速搅拌至水油两相分离（30 min），最后，在350×g、10 min 条件下离心收集微胶囊，并用0.1 mol/l 的CaCl2溶液漂洗3 次，然后将样品用8层纱布滤去多余水分，备用。

1.2.2 微胶囊包被效果评估

1.2.2.1 微胶囊形态观察及粒径分布

采用光学显微镜和扫描电镜观察微胶囊形态结构，采用Beckman Coulter LS2000 激光粒度分析仪测定其粒径分布。

1.2.2.2 微胶囊包被效率的测定[10]

式中：微胶囊中活菌数量为每克湿微胶囊的含菌量与微胶囊总重量的乘积；初始活菌数量为每毫升浓缩菌液的含菌量与浓缩菌液总体积的乘积。

计数方法：取1 ml 样液或1 g 样品加入到9 ml 0.2 mol/l、pH值8.0的磷酸缓冲液中，37 ℃温育10 min，然后用旋涡振荡器（或摇床）震荡10 min，以彻底从微胶囊中释放目标菌，然后用生理盐水溶液进行梯度稀释至合适浓度，涂布MRS 琼脂平板，37 ℃、24 h 左右，计算活菌数。每个样品重复三次。

1.2.2.3 微胶囊在胃肠液中对目标菌的保护效果评估[11]

胃液配制：取浓度为1 mol/ml 的稀盐酸，加水稀释，将pH 值调至1.5。每100 ml 液体中加入1 g 胃蛋白酶，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

肠液配制：取KH2PO46.8 g 加水500 ml 溶解，用0.4%（w/w)的NaOH 回调pH 值至6.8。每100 ml 液体中加入1 g 胰酶粉和2 g 的猪胆盐，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

实验处理：取1 g 各种微胶囊，接入含有15 ml 胃液（pH 值1.5）的灭菌三角瓶内（带橡胶塞），37 ℃、110 r/min、培养2 h。同时，胃液培养结束后，取1 g各种微胶囊，接入含有15 ml 肠液的灭菌三角瓶中（pH值6.8），37 ℃、110 r/min、培养4 h。分别在胃液和肠液培养结束时，按1.2.2.2 中方法进行活菌计数，按下式进行保护效果计算：

胃液中存活率(%)=

肠液中存活率(%)=

1.2.2.4 包衣微胶囊在胃肠液中释放性能评估

取0.2 g各种处理微胶囊，接入含有3 ml胃液（pH值1.5）的10 ml 离心管中，37 ℃、110 r/min、厌氧培养2 h。胃液培养结束后，350×g 离心5 min，去除上清，加入3 ml 模拟肠液（pH 值6.8），继续培养4 h。在胃液和肠液培养过程中，每隔30 min 取一个样品管，测定微胶囊的溶胀性能。

方法：首先将样品进行350×g离心5 min，后将离心后的沉淀，倒扣在8 层灭菌纱布上，去除多余水分后，称重，并与微胶囊初始重量相比。

1.3 数据统计

试验数据使用Excel 2010 进行整理，利用SPSS 19.0 统计软件中的one-way ANOVA 模块进行单因素方差分析，处理间均值采用Duncan's多重比较法进行差异显著性检验。试验数据采用“平均值±标准差”来表示，以P＜0.05为差异显著。

2 实验结果

2.1 复合壁材与目标菌的相容性

嗜酸乳杆菌与2.5%海藻酸钠及2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合壁材的相容性结果见图1。结果显示，无论是2.5%海藻酸钠，还是2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶的组合，对目标菌的生长均无影响，并且在一定程度上促进了嗜酸乳杆菌的生长，尤其是2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶的组合，使嗜酸乳杆菌的活菌数达到了(1.11±0.13)×109CFU/ml。但与对照（MRS肉汤）相比，差异不显著（P＞0.05）。

图1 嗜酸乳杆菌与复合壁材的相容性

2.2 复合壁材微胶囊形态观察

2.5%海藻酸钠微胶囊、2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊在电镜下的整体形态结构图以及表面局部图如图2所示。结果显示，2.5%海藻酸钠微胶囊和2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊均具有较好的圆形度，并且在放大500倍（图2A左、图2B左）情况下，两种微胶囊的外观结构较为平滑和致密（表面为黏附的菌体），但2种微胶囊相比发现，2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊的上述几个方面均比2.5%海藻酸钠微胶囊更优。同时，微胶囊表面局部图（图2A右、图2B右）结果也显示，2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊表面的孔状结构和致密程度对比2.5%海藻酸钠微胶囊均有不同程度的改善。

图2 各种微胶囊整体形态(图2A、B左，×500)及局部形态(图2A、B右，×20K)

2.3 复合壁材微胶囊包被率及其粒径大小(见表2)

表2 微胶囊包被率及粒径大小

表2 展示了2.5%海藻酸钠微胶囊、2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊的包被率和粒径大小。根据1.2.2.2 中公式计算所得2.5%海藻酸钠微胶囊的包被率为（35.08±1.52）%，活菌数（荷载量）为（1.43±0.30）×109CFU/g；2.5%海藻酸钠+0.5%瓜尔豆胶复合璧材微胶囊的包被率为（47.49±1.91）%，活菌数（荷载量）为（1.78±0.44）×109CFU/g。二者相比，差异显著（P＜0.05）。

粒径大小方面，由于瓜尔豆胶的加入，复合壁材微胶囊的直径平均值[(733.01±4.00) μm]显著高于2.5%海藻酸钠微胶囊[(434.71±9.54) μm]（P＜0.05）。

2.4 微胶囊包被目标菌在模拟胃肠液中的存活性能（见图3、图4）

根据图3 所示，未包被嗜酸乳杆菌在模拟胃液（pH 值1.5）中作用2 h 后，嗜酸乳杆菌的活菌数已无法检测到，存活率为0；而用2.5%海藻酸钠作为壁材包被的目标菌经模拟胃液作用2 h 后，存活率为（0.07±0.01）%，活菌数已不足106CFU/g，但与未包被组相比，差异极显著（P＜0.01）；复合壁材包被的目标菌经模拟胃液作用2 h后，存活率达到（0.47±0.02）%，活菌数达到8.32×106CFU/g，与2.5%海藻酸钠组相比差异极显著（P＜0.01）。

图4 展示的是三种处理的目标菌在模拟肠液中作用4 h后的存活率。未包被嗜酸乳杆菌的活菌数已无法检测到，存活率为0；而用2.5%海藻酸钠作为壁材包被的目标菌经模拟肠液作用后，存活率为（0.16±0.03）%，活菌数为2.31×106CFU/g，与未包被组相比，差异极显著（P＜0.01）；复合壁材包被的目标菌经模拟肠液作用后，存活率达到（0.54±0.01）%，活菌数接近107CFU/g，与2.5%海藻酸钠组相比差异极显著（P＜0.01）。

图3 不同处理的嗜酸乳杆菌在模拟胃液中2 h的存活率

图4 不同处理的嗜酸乳杆菌在模拟肠液中4 h的存活率

2.5 复合壁材微胶囊在模拟胃肠液中的释放性能（见图5）

图5 展示了两种微胶囊在模拟胃肠液中溶胀性能的变化趋势。结果显示，2.5%海藻酸钠微胶囊和复合壁材微胶囊进入胃液后，溶胀度快速提升，但最大溶胀点分别发生在进入肠液后的1 h 和2 h，随后则快速下降。

3 分析讨论

3.1 复合壁材对微胶囊物理状态的影响

微胶囊技术是提高乳酸菌及其制剂抗逆能力、发挥其益生特性的有效措施。海藻酸钠也因为其独特的优势成为微胶囊的常用壁材，但有研究表明，因为海藻酸钠微胶囊的多孔性和对酸性条件的敏感，使其对乳酸菌在酸性条件下的存活能力的提高产生阻碍[12]。

图5 两种微胶囊在模拟胃肠液中的溶胀性能

本研究利用具有良好溶解性、黏性、成凝胶特性以及低酸条件下（pH 值3.5 以下）的成膜特性的瓜尔豆胶与海藻酸钠组成复合壁材，包被嗜酸乳杆菌，结果发现，无论是外部整体结构还是局部形态，复合璧材微胶囊表面的孔状结构和致密程度比2.5%海藻酸钠微胶囊均有不同程度的改善（图2）。这其中原因主要是，瓜尔豆胶含有许多活性基团（羟基），能够和很多物质发生反应（醚化和酯化反应），生成相应的化合物并形成更加稳定的结构[13]，赋予瓜尔豆胶具有较好的成膜特性，再加上瓜尔豆胶的黏性，使其能够有效填充海藻酸钠形成的孔状结构，并使微胶囊表面有序致密[14]。一些与瓜尔豆胶具有类似性质的物质，如槐豆胶，也已被证实可以和海藻酸钠复合形成微胶囊，提高对目标菌的保护作用[15]。

包被率和粒径方面，根据表2结果可知，由于瓜尔豆胶的加入，复合壁材微胶囊包被率和平均粒径均显著提高(P＜0.05)。其原因可能与瓜尔豆胶的黏附性有关，因为瓜尔豆胶的主要成分是非离子型半乳甘露聚糖，具有较好水溶性，且在低质量分数下呈现很高的黏度。由于黏度的增加，使壁材对目标菌的黏附能力增强，提高包被率；同样也是因为黏度的增加，同样的搅拌转速对于凝胶分子的分散能力减弱，致使粒径较大。类似的结果也被赵萌等(2015)[16]的研究结果所证实。

3.2 复合壁材对微胶囊包被目标菌生物活性的影响

微胶囊对目标菌的生物活性的影响主要包括两方面，一是是否对包被目标菌抵抗胃酸和肠胆盐的能力有促进作用，二是能否在目标菌发挥功能特性位点及时崩解，释放目标菌。

图3 和图4 的结果表明，复合壁材微胶囊对嗜酸乳杆菌抵抗低酸、胆盐等不利条件的能力具有明显的促进作用，与另两组结果相比差异极显著（P＜0.01）。这说明，瓜尔豆胶的加入有效弥补了海藻酸钠微胶囊多孔的缺陷，减少了胃酸、胆盐等不利条件对嗜酸乳杆菌的活性的影响，进而提高了嗜酸乳杆菌通过胃肠不利环境，到达发挥功能位点的能力。同时，瓜尔豆胶作为一种水溶性膳食纤维，进入肠道后，可以进一步发挥相应的生物活性，如促进体外、体内（大肠）有益菌群的增加[17-18]，促进中短链脂肪酸产生[19]等，保护肠道健康。本研究也得到了类似的结果（图1），但由于加入量较少（0.5%）的原因，对目标菌活性的促进效果组间差异不显著（P＞0.05）。

溶胀性能是评估微胶囊的释放性能的常用指标之一[20]。一般认为，微胶囊溶胀程度越高，崩解速度就越慢，包被的目标菌的释放速度就越慢，微胶囊的释放性能就越差。据图5可知，2.5%海藻酸钠微胶囊和复合壁材微胶囊分别在进入肠液后的1 h 和2 h达到最大溶胀点，也即是在此处达到最大释放性能。二者相比，2.5%海藻酸钠微胶囊比复合壁材微胶囊具有更佳的肠溶性能，这可能和瓜尔豆胶能够与海藻酸钠形成更加稳定的结构有关。但是，由于2.5%海藻酸钠在胃液中对目标菌不能提供较好的保护作用，因此到达肠液后，也无法实现目标菌的益生功能；然而，复合壁材微胶囊虽然最大释放点比2.5%海藻酸钠微胶囊延迟1 h，根据Cook等（2012）[21]的观点，食物在小肠中停留的时间大约为(3.2±1.6) h，因此进入肠道2 h达到最大释放，并不影响目标菌功能特性的发挥。

4 结论

利用具有较好生物相容性的瓜尔豆胶与海藻酸钠组成复合壁材，包被嗜酸乳杆菌，不但有效改善了微胶囊的外观结构、包被率，更重要的是，在不影响嗜酸乳杆菌在肠道中及时释放情况下，显著促进了嗜酸乳杆菌抵抗胃液低酸环境、肠道胆盐作用等不利条件的能力，增强了其耐受性和存活率，为嗜酸乳杆菌生物功能的发挥提供了保证，也为本研究成果的未来应用奠定基础。