Smac过表达对食管鳞癌细胞Warburg效应和细胞凋亡的影响

朱立强,张 乐，李庆华,张彦婷,张璐玉,刘腾飞,关方霞

1)郑州大学第二附属医院检验科 郑州 450014 2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的病理组织类型大多数是鳞癌。近年来，国内的相关研究取得了一些进展，但食管鳞癌发生的分子机制和遗传基础仍未揭示，因此分析食管鳞癌组织或细胞中异常表达的蛋白，并探究其作用机制，有助于揭示食管鳞癌的分子机制和遗传基础。线粒体作为细胞能量代谢和凋亡的重要细胞器，在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用[1]。在氧气充足的条件下，肿瘤细胞的能量代谢(即Warburg效应)主要依赖糖酵解途径而不是正常的三羧酸循环[2]；另外，肿瘤细胞内部分促凋亡相关基因表达下调[3]；以上过程均与线粒体有关。Smac/DIABLO(第二线粒体激活剂)基因作为线粒体凋亡通路中关键的调节基因，在食管鳞癌组织和细胞中低表达[4]；前期实验[5]表明，Smac基因过表达或者Smac类似物处理都能够增强化疗以及放疗对胶质瘤细胞凋亡的诱导效果。本研究以Warburg效应为切入点，探究Smac过表达对食管鳞癌细胞凋亡和线粒体能量代谢的影响，从而揭示Smac蛋白与线粒体功能之间的相互作用，为食管鳞癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料食管鳞癌Eca109和EC1细胞株购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。含Smac过表达载体和空载体的慢病毒购自上海GenePharma公司，细胞全蛋白提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，线粒体膜电位检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，β-actin、Smac、细胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2、Caspase-3前体、己糖激酶Ⅱ(HK2)、乳酸脱氢酶(LDH)蛋白一抗、二抗均购自武汉三鹰生物科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，标准胎牛血清(FBS)购自以色列BI公司，胰蛋白酶及RPMI 1640培养基均购自美国HyClone公司，过氧化氢购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2细胞培养Eca109和EC1细胞均以含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养基，于体积分数5%的CO2、37 ℃条件下培养。用倒置光学显微镜观察细胞形态、状态和密度，待生长密度达70%～80%时传代。1～2 d换一次培养基，待细胞生长状态良好即可用于后续实验。

1.3Smac过表达细胞株的构建实验前1天接种3 000～5 000个Eca109或EC1细胞于96孔板，加入100 μL完全培养基，过夜培养。根据预实验结果，感染复数选为10，将含Smac过表达载体和含空载体的慢病毒分别感染Eca109和EC1细胞(分别为过表达组和阴性对照组)，并用嘌呤霉素筛选出稳定表达株。以未感染细胞为空白对照组。收集细胞，提取总蛋白，定量后，采用SDS-PAGE分离蛋白，电泳结束后将胶转移至PVDF膜上，用50 g/L的脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入Smac蛋白一抗(按1∶1 000稀释)，以β-actin(抗体按1∶2 000稀释)为内参，4 ℃孵育过夜，然后室温条件下加山羊抗兔二抗(按1∶2 000稀释)孵育2 h，ECL显像，用Image J软件进行灰度分析。Smac蛋白表达水平以目的条带与内参条带灰度值的比值表示。实验重复3次。

1.4过氧化氢干预后细胞线粒体膜电位的检测采用JC-1荧光探针法。取Smac过表达组和阴性对照组细胞，用300 μmol/L过氧化氢处理3 h，诱导细胞损伤。PBS洗涤2～3次后，加入1 mL新鲜培养基和1 mL的JC-1染色工作液，充分混匀，于37 ℃培养箱孵育20 min，随后加入1 mL的JC-1染色缓冲液洗2次，最后加入2 mL完全培养液置于荧光倒置显微镜下观察拍照。线粒体膜电位以绿/红荧光比表示,比值升高表示线粒体膜电位降低。实验重复3次。

1.5过氧化氢干预后细胞凋亡率检测采用Annexin V-FITC/PI双染法。将Smac过表达组和阴性对照组细胞分别接种到6孔板中，细胞密度为1×105个/孔，37 ℃培养过夜。用300 μmol/L过氧化氢处理细胞3 h，用PBS清洗2次，然后用不含EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞，1 500 r/min离心5 min，再用500 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀，室温避光放置15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.6过氧化氢干预后细胞中凋亡相关蛋白和Warburg效应关键蛋白表达的检测用300 μmol/L的过氧化氢诱导Smac过表达组和阴性对照组细胞损伤后，采用Western blot法检测细胞内凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前体的表达情况；同时，采用Western blot法检测慢病毒感染后不同时间点(第1、3、7天)细胞内Warburg效应关键蛋白(HK2、LDH)的表达。方法同1.3，Smac、Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前体、HK2、LDH一抗均按1∶1 000稀释。实验均重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组Smac蛋白、LDH和HK2蛋白表达的差异，应用两独立样本t检验比较过氧化氢干预后阴性对照组和Smac过表达组线粒体膜电位、细胞凋亡率及Smac、Cyt-C、Bcl-2和Caspase-3前体蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1Smac过表达细胞株的鉴定Western blot结果见图1。与空白对照组和阴性对照组相比，Smac过表达组细胞中Smac的表达水平升高(表1)，提示成功构建了Smac过表达细胞株。

1～3：分别为Eca109细胞的空白对照组、阴性对照组及Smac过表达组；4～6：分别为EC1细胞的空白对照组、阴性对照组及Smac过表达组

图1两种细胞不同组别Smac蛋白的表达

表1 两种细胞不同组别Smac蛋白表达水平比较(n=3)

*:与其他2组相比，P<0.05

2.2Smac过表达对过氧化氢干预后Eca109和EC1细胞线粒体膜电位、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的影响过氧化氢处理后，与阴性对照组相比，Smac过表达组细胞线粒体膜电位(图2)降低(绿/红荧光比升高)，细胞凋亡率升高(表2)。Bcl-2和Caspase-3前体蛋白的表达下调，Cyt-C蛋白的表达升高(图3，表3、4)。

图2 Smac过表达对过氧化氢干预后Eca109和EC1细胞线粒体膜电位的影响(×200)

表2 Smac过表达对Eca109和EC1细胞绿/红荧光比和细胞凋亡率的影响(n=3)

1、2：Eca109细胞的阴性对照组和Smac过表达组；3、4：EC1细胞的阴性对照组和Smac过表达组

图3Smac过表达对凋亡通路相关蛋白表达的影响

表3 Smac过表达对Eca109细胞中凋亡相关蛋白表达的影响(n=3)

*:与阴性对照组相比，P<0.05

表4 Smac过表达对EC1细胞中凋亡相关蛋白表达的影响(n=3)

*:与阴性对照组相比，P<0.05

2.3Smac过表达对Eca109和EC1细胞Warburg效应关键蛋白表达的影响与阴性对照组相比，Smac过表达组HK2和LDH的表达随着时间的推移逐渐降低(图4、表5)，说明过表达Smac蛋白可促进Eca109和EC1细胞的糖酵解作用。

上：Eca109细胞；下：EC1细胞；1～4：分别为阴性对照组，Smac过表达组1、3、7 d

图4 Smac过表达对Eca109和EC1细胞Warburg效应关键蛋白表达的影响

*:与阴性对照组相比，P<0.05

3 讨论

线粒体作为细胞能量代谢和不可逆的凋亡反应中重要的细胞器，在肿瘤的发生过程中发挥了双重作用。肿瘤细胞的能量变化(Warburg效应)影响线粒体的代谢功能，是影响肿瘤进展的关键机制之一，现已成功应用于恶性肿瘤的临床诊断中，是未来肿瘤治疗的新方向[5-7]。肿瘤细胞利用有氧糖酵解过程产生的大量代谢前体物质满足快速增殖对于大分子合成代谢的需要[8]。我们的研究发现Smac过表达后食管鳞癌细胞中LDH蛋白的表达下调，而代表细胞糖酵解过程的关键限速酶HK2的表达也下降，说明Smac基因的过表达可有效限制肿瘤细胞的Warburg效应。

Smac基因位于12号染色体的长臂端，可编码239个氨基酸，合成相对分子质量为27 000的Smac前体蛋白[9]，其氨基端的前55个氨基酸残基构成了线粒体靶向序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)，确保Smac前体蛋白定位在线粒体膜。当受到外界凋亡刺激(如氧化损伤)时，Smac前体蛋白的MTS被剪切后，形成21 000的成熟Smac蛋白，从线粒体膜间隙进入到胞质中，过程伴随着Cyt-C的释放，随后引发凋亡程序[10]。细胞线粒体膜电位的变化是细胞早期凋亡的标志之一。本研究采用线粒体膜电位法检测了Smac过表达的食管鳞癌Eca109和EC1细胞在过氧化氢刺激后细胞早期凋亡情况，同时采用Annexin V-FITC/PI双染法检测了细胞晚期凋亡，并检测了细胞凋亡相关蛋白(Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前体)的变化情况，结果表明Smac在食管鳞癌细胞中发挥促凋亡作用，其机制可能与Smac/Cyt-c-IAP-Caspase-3信号通路有关，这与之前的研究[11-12]结果一致。

综上所述，本文验证了Smac蛋白通过线粒体凋亡通路引发食管鳞癌细胞的凋亡过程，而且首次在能量代谢水平上揭示了Smac基因的影响，为进一步揭示食管鳞癌细胞线粒体功能代谢机制提供了可能性。