多黏菌素B药敏条在肠杆菌科药敏检测中应用研究

郑业焕 李轶 金湘东 荆鹏伟

(1 郑州安图生物工程股份有限公司，郑州 450016；2 河南省人民医院，郑州 450003；3 郑州铁路职业技术学院，郑州 450052；4 河南中医药大学第一附属医院，郑州 450008)

肠杆菌科细菌是革兰阴性菌中非常重要的一类微生物，是引起临床感染的重要病原菌之一，可致化脓性疾病、肺炎、脑膜炎、菌血症以及伤口、泌尿道和肠道的感染[1-2]。多黏菌素是从多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)培养液中获得的多肽类抗生素，根据化学结构共分为5型，其中仅B和E应用于临床，主要用于治疗革兰阴性菌所致的全身多位点感染，因其较严重的肾毒性及神经系统毒性曾经一度被弃用。近年来，随着抗生素的广泛应用，肠杆菌科细菌对多种抗菌药物产生了耐药性，多黏菌素类作为治疗的最后选择又被应用于临床[3-4]。本研究结合最新2018版美国临床实验室标准化研究协会(CLSI)M100-S28标准[5]，收集了2018年上半年河南省人民医院、河南省中医一附院、郑州大学二附院临床分离肠杆科菌株887株，同时采用E-test法和微量稀释法进行体外药敏试验，考察两种方法的一致性，为临床肠杆菌科细菌体外多黏菌素药敏试验提供参考，指导临床合理进行体外药敏检测。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

本研究收集了2018年1月—6月河南省人民医院、河南省中医第一附属医院、郑州大学第二附属医院临床常规分离肠杆科菌株887份，其中埃希菌属331株，克雷伯菌属207株，沙门菌属103株，志贺菌属112株，其他属肠杆菌134株(肠杆菌属57株，柠檬酸杆菌属48株，耶尔森菌属13株，摩根菌属7株，布丘菌属6株，西地西菌属3株)。质控菌株采用ATCC标准菌株：大肠埃希菌(ATCC25922)、产酸克雷伯菌(ATCC700324)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、肺炎克雷伯菌肺炎亚种(ATCC13883)、肠炎沙门菌(ATCC13076)、鼠伤沙门菌(ATCC14028)、索氏志贺菌(ATCC25931)、霍氏肠杆菌(ATCC700323)、人苍白杆菌(ATCC49687)、人苍白杆菌(ATCCBAA-749)均源于郑州安图生物工程股份有限公司。

1.2 试剂

多黏菌素B药敏条由郑州安图生物工程股份有限公司提供，血琼脂平板、90mm Mueller-Hinton(MH)平板均由郑州安图生物工程股份有限公司提供。多黏菌素B抗菌药物为标准品，购自中国食品药品检定研究院；MH肉汤购自于BD医疗器械(上海)有限公司。

1.3 方法

按照多黏菌素B药敏条说明书进行操作。待测菌株和质控菌株分纯过夜，挑取纯菌落制备浊度为1.5×108CFU/mL浓度菌液，用无菌棉签浸蘸菌液涂布于90mm MH平板表面，放置5min后，用真空吸笔吸取药敏条放置于平板上然后放置(35±1)℃孵育，孵育16～20h后，读取抑菌圈边缘与药敏条相交位置处的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。微量稀释法的操作和判读参照CLSI标准：在96孔酶标板的2～12孔各加100μL肉汤培养基；加100μL含64μg/mL抗生素的肉汤培养基至第1和第2孔中；从第2～12孔作对倍稀释；加100μL含有105CFU待检细菌新鲜肉汤培养基于每一孔；设立阳性对照孔，阴性对照孔，抗生素对照孔；密封酶标板，(35±1)℃环境下孵育20～24h，当阳性对照孔明显浑浊时，记录MIC值。EA(essential agreement)：指待测方法与对比方法(或参考方法)MIC值在±1个稀释倍数范围内的一致性[5-7]。药敏条与微量稀释法比对超过±1个稀释倍数时进行复测，复测仍然超过±1个稀释倍数判为不一致[7]。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＞0.05为无显著性差异。

2 结果

2.1 质控菌株检测结果

本次质控选用的9株ATCC标准菌株，均重复3次检测，其中仅大肠埃希菌ATCC25922在CLSI有质控范围为0.5～2μg/mL，采用微量稀释法和药敏测定MIC值均在±1个稀释倍数范围内，符合性能要求，具体数据见表1所示。

2.2 样本结果分析

共计887株肠杆菌的比对中，873株用药敏条和微量稀释法测定MIC值在±1个稀释倍数的范围内。其中完全一致的有594株(594/887,66.97%)，±0.5个稀释倍数的有170株(170/887,19.17%)，±1个稀释倍数的有86株(86/887,9.70%)。有45株菌的MIC值超出了±1个稀释倍数，EA%为94.93%(842/887)，针对第一次测定不符合的经复测确认，有36株菌测定结果仍然不符合，即纠正后的EA%为95.94%(851/887)，结果见表2所示。

表1 标准菌株重复3次检测结果Tab.1 Test results for standard strains repeated three times

2.3 不一致结果分析

两种方法MIC值超过|±1|个稀释倍数的36株，测定MIC值见表3所示，相关性分析：P=0.012＜0.05，说明药敏条检测结果与微量稀释法检测结果具有显著的线性相关。配对检验结果中的P＞0.05，说明两者结果差异不明显。

表2 两种方法所测MIC值EA结果Tab.2 EA results of MIC values measured by two methods

2.4 不同类间分析

针对887株肠杆菌科细菌按照不同种属分类，计算其EA一致性，埃希菌属的EA为95.77%(317/331)，克雷伯菌属的EA为96.14%(199/207)，沙门菌属的EA为97.09%(100/103)，志贺菌属的EA为96.43%(108/ 112)，其他属肠杆菌的EA为94.03%(126/134)，并对这5种进行显著性差异分析，结果见表4所示。

3 讨论

目前，体外抗菌药物敏感性试验技术主要包括纸片扩散法、微量肉汤稀释法、商品化全自动微生物分析系统(如Vitek-Compact,BD Phoenix)和E-test法等。其中，纸片扩散法操作简单、对实验室要求较低，且花费较低，适合临床实验室尤其是基层医院使用[8-9]。微量肉汤稀释法是美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的参考方法，但该方法操作繁琐，暂无全自动系统出现，并且板卡抗菌剂种类固定，影响临床推广使用。商品化全自动微生物分析系统使用方便，但价格较昂贵且需要特殊仪器设备、抗菌药物选择相对固定、测定浓度范围较窄[10]，故在常规应用中存在一定局限性。E-test法则综合了MIC法与纸片扩散法的优点，操作简单、可得到具体的MIC值、测定浓度范围宽、可选择的药物较多等，近些年来逐渐受到了实验室的认可。然而多黏菌素在琼脂中不易扩散导致该方法可靠性降低[3]，2018版CLSI M100-S28中针对黏菌素(多黏菌素B)药敏体外检测新增备注说明，针对铜绿假单胞菌和不动杆菌建议采用的微量肉汤稀释法，删除纸片扩散法和E-test法折点范围，备注说明，不建议采用纸片扩散法和E-test法药敏条。本研究参考指南，采用ATCC标准株进行平行体外药敏试验，ATCC菌株确保检测的可溯源性，质控菌株检测结果均一致，即E符合率为100%，说明了试验结果的有效性。

表3 超过|±1|个稀释倍数36株临床菌株检测MIC值Tab.3 The MIC outside |±1| dilution ration of 36 clinical strains

表4 肠杆菌科不同属检测EA一致性分析Tab.4 EA consistency analysis of different genus of Enterobacteriaceae

本研究对887株肠杆菌科细菌，分别采用微量肉汤稀释法、E-test法进行体外药敏试验，测定抗菌药物的MIC，并统计分析两种方法检测MIC的一致性。共计887株肠杆菌的比对中，有45株菌的MIC值超出了|±1|个稀释倍数，经复测确认，有36株菌测定结果仍然不符合，即纠正后的EA%为95.94%(851/887)。统计学χ2方检验，采用P＞0.05，二者无显著性差异，针对复测后36株菌株的一致性超过±1个稀释倍数，推测可能是方法学或菌株的差异所致，也可能与药敏检测所用MH培养基的pH值、组分差异有关[3]。针对887株肠杆菌科细菌按照不同种属分成5类进行分析，EA值最高的为沙门菌属的97.09%(100/103)，EA最低的为其他属肠杆菌的94.03%(126/134)，并对这5种进行显著性差异分析，P=0.801＞0.05，美国食品药品监督管理局(FDA)标准[11]中对药敏检测试剂性能评价要求与微量肉汤稀释法比对大于90%，该研究中比对一致性均高于94%，说明肠杆菌科细菌使用E-test法药敏条试剂是性能满足预期要求。针对36株临床菌检测MIC值，相关性分析：P=0.012＜0.05，说明药敏条检测结果与微量稀释法检测结果具有显著的线性相关，配对检验结果中的P＞0.05，说明两者结果差异不明显。

体外药敏试验是临床选择抗菌药物治疗的重要参考依据，准确的药敏试验对临床极为重要。目前全世界关于多黏菌素的E-test法耐药值折点问题仍无统一认识，而多黏菌素将越来越广泛地应用于临床多重耐药革兰阴性菌感染的治疗。在本研究中，多黏菌素B药敏条用于肠杆菌科检测时，E-test法和微量稀释法具有很高的一致性，说明E-test法多黏菌素药敏条可用于临床肠杆菌科体外药敏检测。