基于MTT 法研究唐古特大黄多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用

李龙昱

(青海省人民医院药学部)

大黄含有丰富的多糖类物质，具有抗肿瘤的生理效能，但具体情况不明[1]。本研究采用MTT法研究唐古特大黄多糖在不同浓度(25～500μg/mL)和不同作用时间(24、48、72h)对人结肠癌细胞KM12、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞549、胃癌细胞SGC-790生存率的影响，来明确唐古特大黄多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM培养基(美国HyClone)；RPMI-1640培养基(南京建成)；胎牛血清(以色列Bioind)；青链霉素混合液(双抗)(美国Gibco)；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液(德国BioFroxx)；DMSO(德国BioFroxx)；乙二胺四乙酸(广州臻萃质检服务有限公司)；PBS磷酸盐缓冲液(美国HyClone)；MTT噻唑兰(德国BioFroxx)。细胞培养瓶(Corning公司)；移液器器(Eppendorf)；细胞培养板(Corning公司)。D-葡萄糖醛酸(南京春秋生物有限公司，纯度98%)。

1.2 试药与细胞株

唐古特大黄多糖的制备方法参照文献方法[5]，冷冻干燥后分装与冻存管中，置-20 ℃冰箱备用。

人结肠癌细胞KM12(ATCC细胞库)；人肝癌细胞HepG2(ATCC细胞库)；人肺癌细胞A549(ATCC细胞库)；人胃癌细胞SGC-790(ATCC细胞库)。

1.3 仪器与设备

细胞实验超净工作台(SW-CJ-4FD，苏州苏净仪器自控设备有限公司)；二氧化碳孵箱(MCO-20AIC，美国Thermo)；倒置显微镜(北京世纪科信科学仪器有限公司，BLD-200)；高压锅(TOMY Autoclave ES-315)；离心机(美国LabNet公司)；-80 ℃冰箱(TH-86-150-WA，上海精若科学仪器)；全自动酶标仪(SpectraMaxiD，美谷分子仪器(上海)有限公司)；电热恒温干燥箱(gz008，东莞市格普电子科技有限公司)；震荡混悬仪(HYG-803，武汉华能阳光电气有限公司)；高速台式离心机(H1650，湘仪集团)；分析天平(AR224CN，上海奥豪斯仪器有限公司)。

1.4 实验方法

采用MTT法研究唐古特大黄多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用，具体研究方法参照文献方法[6]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 唐古特大黄多糖对人结肠癌细胞KM12的抑制作用

唐古特大黄多糖在不同作用时间下对人结肠癌细胞KM12抑制率如图1所示，浓度范围介于25～500 μg/mL的唐古特大黄多糖在24、48、72 h时对胰腺癌细胞的抑制率随着浓度的增加对人结肠癌细胞KM12的抑制作用越明显，不同浓度的抑制作用具有显著性差异(P<0.05)。比较相同浓度不同的作用时间，发现随着作用时间的延长，抑制率逐渐提高。由于多糖是大分子物质，不易被细胞所吸收，所以其对肿瘤细胞的抑制作用随时间的延长而增强，当作用时间为72 h、浓度为500 μg/mL的唐古特大黄多糖对人结肠癌细胞KM12的抑制率为80.25±3.44%。结果显示唐古特大黄多糖对结肠癌细胞具有较好的抑制作用。

2.2 唐古特大黄多糖对人肝癌细胞HepG2的抑制作用

唐古特大黄多糖对人肝癌细胞HepG2抑制作用如图2所示，浓度范围介于25～500 μg/mL的唐古特大黄多糖作用于人肝癌细胞24、48、72 h后，均有明显的抑制作用，且量效关系明显(P<0.05)。抑制作用随着作用时间的延长而增加。如图2所示当作用时间为72 h、浓度为500 μg/mL的唐古特大黄多糖对人肝癌细胞的抑制率为88.23±2.12%。结果显示唐古特大黄多糖对肝癌细胞具有较好的抑制作用。

2.3 唐古特大黄多糖对人肺癌细胞A549的抑制作用

唐古特大黄多糖在不同作用时间下对人肺癌细胞A549抑制率如图3所示，唐古特大黄多糖在浓度范围介于25～500 μg/mL时对肺癌细胞的抑制作用不太显著，作用时间为24 h时，抑制率最高为5.65%，且不同剂量之间无显著性差异。随着作用时间的延长，表现出微弱的抗肿瘤活性，作用时间为72 h、浓度为500 μg/mL的唐古特大黄多糖抑制率仅为35.32±3.34%。结果显示唐古特大黄多糖对人肺癌细胞A549的抑制作用较弱。

图1不同作用时间下唐古特大黄多糖对人结肠癌细胞KM12的抑制率图

Figure1Inhibition rate of tanguficanmaxim polysaccharides on human colon cancer cells KM12at different time

图2 不同作用时间下唐古特大黄多糖对人肝癌细胞HepG2的抑制率图

图3 不同作用时间下唐古特大黄多糖对人肺癌细胞A549的抑制率图

2.4 唐古特大黄多糖对人胃癌细胞SGC-790的抑制作用

唐古特大黄多糖对人胃癌细胞SGC-790抑制作用如图4所示，浓度范围介于25～500 μg/mL的唐古特大黄多糖作用于SGC-790人胃癌细胞24、48、72 h后，均有明显的抑制作用，且量效关系明显(P<0.05)。抑制作用随着作用时间的延长而增加。作用时间为72 h、浓度为500 μg/mL的唐古特大黄多糖对胃癌细胞SGC-790抑制率为89.54±4.25%结果显示唐古特大黄多糖对胃癌细胞SGC-790具有一定的抑制增殖作用。

图4不同作用时间下唐古特大黄多糖对人胃癌细胞SGC-790的抑制率图

Figure4Inhibition rate of tanguficanmaxim polysaccharides on human gastric cancer cells SGC-790at different time

3 讨论

中医认为，恶性肿瘤与热毒蕴结密切相关。因此，具有清热解毒的中药，是近年来防治恶性肿瘤的研究热点。通过查阅不同文献发现清热解毒中药抗肿瘤的作用机制主要为：直接杀灭肿瘤细胞、调控机体中的特定信号使肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫功能、抗炎、抗氧化[8，9]。大黄味苦性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具沉降之性，有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，活血祛瘀之功效，是一味泻火、破积、行瘀的中药，因此适用于癌症的治疗[10]。研究结果表明，唐古特大黄多糖对人结肠癌细胞KM12、肝癌细胞HepG2、胃癌细胞SGC-790具有显著抑制作用，且表现出较好的量效关系和时间依赖关系，而对肺癌细胞的抑制作用不明显，推测唐古特大黄多糖抗肿瘤活性可能与其性味归经有关。中医药的治疗注重归经。归经能从一定程度反映出中药的作用部位或者作用靶点。药物进入体内，经过吸收后在不同的组织中分布差异较大[11]。药物的作用与人体的脏腑经络密切相关，药物对机体作用部位也具有选择性，结合中药的归经可以为临床辩证用药提供依据[12]。本次研究结果从侧面上反映了唐古特大黄在抗肿瘤方面具有一定的选择性。因此后续可结合性味归经理论探究唐古特多糖治疗肿瘤的作用靶点。多糖是大黄中一类重要的活性成分，其抗肿瘤作用逐渐被人认可，前期已经证实唐古特大黄具有显著的免疫调节作用，其抗肿瘤活性与免疫调节之间的关系是一个值得探究的科学问题。本研究通过体外实验明确了唐古特大黄多糖对不同肿瘤细胞生存率的影响，而药物进入人体需经吸收、分布、代谢和排泄四个步骤，影响因素较多，因此体内实验结果是否与体外实验一致还有待进一步明确。