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天麻素对小鼠放射性心脏损伤的保护作用※

2019-12-03冯瑞兴刘子宁

中国高原医学与生物学杂志 2019年3期
关键词:天麻心肌细胞试剂盒

李 鹏,陈 凡,冯瑞兴,王 财,刘子宁

(1.青海大学医学院;2.青海大学附属医院,青海 西宁 810001)

对放射性心脏损伤(RIHD)在临床上缺乏有效干预药物。近来相关临床与基础研究表明[1-4],天麻素对心肌损伤具有保护作用,本研究拟探讨天麻素对RIHD的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

50只C57bL/6小鼠,4~6 周龄,体质量为20.2±1.0 克,购于西安交通大学医学部实验动物中心[动物许可证号SCXK(陕)2017-003]。4%的多聚甲醛液(PH0427)、蛋白酶K、二甲苯(PH18JAN014、PH18JAN008)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供;IL-6ELISA试剂盒由上海玉博生物科技有限公司提供;Caspase-3抗体、兔抗羊 IgG-HRP二抗(20180716、20180911)由南京建成生物公司提供;TUNEL试剂盒、SOD和MDA试剂盒(Lot:091518181116、102318191154、112018181204)由碧云天生物提供;天麻素注射液(04871212A)由悦康药业集团有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 建模

所有小鼠经适应性喂养7 d后随机分为对照组,单纯照射组,照射+天麻素低、中、高剂量干预组(50、100、150mg/kg),每组10只。除对照组外,各实验组小鼠用放疗加速器采用18 Gy的剂量照射建立小鼠RIHD模型[5]。具体方法:小鼠在照射前3 min称体重,用2%的水合氯醛行腹腔麻醉后置于治疗床上,固定四肢,将激光灯定位于心尖搏动部,设置大约1 cm×1 cm照射野,局部照射心脏,源皮距100 cm,剂量18 Gy,剂量率4 Gy/min,照射完成后使小鼠自然苏醒,继续饲养。

1.2.2 药物干预

造模后对各天麻素干预组进行药物干预。具体方法:于照射前3 d开始,参照文献方法[6-8]:各组小鼠分别按50、100、150 mg/kg的剂量每天一次于腹腔注射天麻素液,非药物干预组小鼠于腹腔注射等体积的0.9%生理盐水。于照射后第4周周末处死小鼠,检测小鼠心肌细胞的凋亡率和血清IL-6及caspase-3、SOD、MDA水平。

1.2.3 造模后小鼠生理情况观察及病理切片的制备

造模结束后,在实验进程中密切观测小鼠摄食(水)及活动情况,每隔三日称取小鼠体重一次并记录。

用2%的水合氯醛采用腹腔注射的方式将小鼠麻醉后,在无菌条件下,取部分心脏组织置于PBS试管中,冲洗干净;经多聚甲醛液固定后行梯度脱水、二甲苯透明,包埋于石蜡中后切片(2~3μm)行HE染色。

1.2.4 血清IL-6水平检测

采集小鼠的外周血(2mL)离心(2500r/s)5 min,分离血清,然后采用IL-6 ELISA试剂盒进行含量测定,并严格依照试剂盒的说明书进行操作。

1.2.5 心肌细胞凋亡率检测

利用制作病理切片时的石蜡包块切片(2~3μm),按照TUNEL试剂盒的说明书进行操作,制备好后的样片使用显微镜进行观察,深棕色者为凋亡细胞。选择10个视野计数,统计凋亡细胞和细胞总数,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞数×100%。

1.2.6 caspase-3表达水平检测

取适量心脏组织,加一定比例的裂解液处理后离心(3000r/s)5 min,取上清液调至等浓度,上样,电泳。电泳结束后将蛋白转移到膜(NC)上,封闭,结合caspase-3一抗在4 ℃下孵育过夜,洗涤后,再结合二抗后用PBS液漂洗3次,将膜固定,经HRP-ECL发光法曝光、显影后观察结果,计算caspase-3水平的相对表达量。

1.2.7 心肌细胞SOD、MDA含量检测

取适量心肌组织样品,加入SOD、MDA样品制备液匀浆后离心(12000g)4~5 min,取上清液待测。分别用WST-8和硫代巴比妥酸法检测SOD、MDA含量,操作严格按照试剂盒说明进行。利用全自动分光光度计分别于450、532 nm处检测SOD、MDA的吸光度,依此进行含量计算。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般生理情况

与对照组比较,各实验组小鼠经照射后均表现出不同程度的摄食(水)减弱、活动不积极现象,小鼠被照射区域有脱毛现象。经照射后,各实验组小鼠体重均有不同程度下降,于后期开始慢慢恢复。表1为4周末5组小鼠的体重比较:与对照组比较,单纯照射组小鼠体重明显下降;与单纯照射组比较,中、高剂量药物干预组小鼠体重升高明显,差异具有统计学意义(P<0.05);与单纯照射组比较,低剂量药物干预组小鼠体重升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。

Table 1 Comparison of body weight among 5 groups of

*:P<0.01,与对照组比较;#:P>0.05,##:P<0.05,###:P<0.01,与单纯照射组比较

2.2 5组小鼠心肌组织病理变化情况

图1显示,对照组心肌纤维排列自然、清晰,间质无明显的炎性细胞浸润,肌间隙无增宽,细胞无萎缩与肥大(A);与对照组比较各实验组小鼠均可见不同程度的局部炎性细胞浸润,心肌纤维排列欠规则,部分可见心肌纤维断裂、胞浆溶解、横纹消失等心肌损伤的表现,以单纯照射组最重(B);与单纯照射组比较,天麻素干预可使以上心肌损伤的改变有不同程度的减轻,尤其见于中、高剂量组(D、E)。

图15组小鼠心肌组织病理变化图(HE,×400)

Figure1Pathological changes of myocardial tissue in5groups of mice(HE,×400)

2.3 5组小鼠血清中的IL-6的比较

表2显示,与对照组比较,单纯照射组小鼠外周血血清IL-6的水平明显提高;与单纯照射组比较,低、中、高剂量药物干预组小鼠血清IL-6含量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。

Table 2 Comparison of serum IL-6 in 5 groups of

*:P<0.01,与对照组比较;##:P<0.05,###:P<0.01,与单纯照射组比较

2.4 5组小鼠的心肌细胞凋亡率的比较

表3显示,与对照组比较,单纯照射组小鼠心肌细胞凋亡率明显增加;与单纯照射组比较,中、高剂量药物干预组小鼠心肌细胞凋亡率明显降低,具有统计学意义(P<0.05);与单纯照射组比较,低剂量药物干预组小鼠心肌细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

Table 3 Comparison of apoptosis rate of myocardial cells in 5 groups of

*:P<0.01,与对照组比较;#:P>0.05,##:P<0.05,###:P<0.01,与单纯照射组比较

2.5 5组小鼠的心肌细胞caspase-3水平的比较

图2、表4显示,与对照组比较,单纯照射组小鼠心肌细胞caspase-3表达水平明显提高;与单纯照射组比较,中、高剂量药物干预组小鼠心肌细胞caspase-3表达水平明显降低,具有统计学意义(P<0.05),与单纯照射组比较,低剂量药物干预组小鼠心肌细胞caspase-3表达差异无统计学意义(P>0.05)。

A:对照组 B:单纯照射组 C、D、E:低、中、高剂量药物干预组

图25组小鼠心肌细胞中caspase-3的表达图

Figure2Expression of caspase-3in myocardial cells of5groups of mice

Table 4 Comparison of caspase-3 levels in 5 groups of

*:P<0.01,与对照组比较;#:P>0.05,##:P<0.05,###:P<0.01,与单纯照射组比较

2.6 5组小鼠的心肌细胞SOD、MDA水平的比较

表5显示,与对照组比较,单纯照射组小鼠心肌细胞SOD表达水平明显减弱,MDA水平明显增强;与单纯照射组比较,中、高剂量药物干预组小鼠SOD表达水平明显升高,MDA水平明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05);与单纯照射组比较,低剂量药物干预组小鼠SOD、MDA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

Table 5 Comparison of SOD and MDA levels in myocardial cells in 5 groups of

*:P<0.01,与对照组比较;#:P>0.05,##:P<0.05,###:P<0.01与单纯照射组比较

3 讨论

目前,随着放疗技术的进步,恶性肿瘤的控制率有了大幅度的提高,放疗患者生存周期得以延长,这使得早期一些无法被随访到的RIHD病例被报道。RIHD严重影响放疗患者后期的生存质量,重者可至死亡,抵消了治疗的益处,因此药物干预RIHD并发症的发生具有很大的临床意义。目前关于天麻素对RIHD保护作用的研究未见报道,值得我们进一步去探讨。

本研究结果显示,天麻素可减轻小鼠心肌细胞的放射性心脏损伤,可能通过下调心肌细胞氧化应激反应、降低细胞凋亡及抗炎来实现保护作用。

天麻素苷作为天麻素中的重要成分,对小鼠的大脑、心脏、肾脏等重要器官的缺血损伤起到抑制作用[9]。有研究[10]显示采用天麻素可通过降低星形胶质细胞活化和降低IL- 6、TNF-α的表达水平改善甲基苯丙胺依赖所致神经功能损害。这说明了天麻素可通过抗炎性反应起到保护作用。本研究的结果显示经不同剂量天麻素处理的各组小鼠的IL-6水平均有明显降低,这说明了天麻素具有抗炎性反应的作用。

RIHD的一个主要表现形式就是细胞的凋亡[11]。细胞凋亡的过程是由Caspase家族激活引发的一系列级联反应[12],Caspase-3被认为是Caspase家族的关键核心酶,许多学者将其活化作为细胞凋亡的标志[13]。因此利用心肌组织内caspase-3含量的高低可以很好反映RIHD的情况。本研究结果显示,与单纯对照组比较,低剂量天麻素干预组小鼠心肌细胞Caspase-3的表达水平及细胞凋亡率略有降低,但差异无统计学意义。随着天麻素剂量的升高,中、高剂量的天麻素干预组小鼠心肌细胞的凋亡率及Caspase-3的表达水平明显降低,对RIHD发挥保护作用。

放射线引起心脏损伤的另一个主要表现就是出现心肌细胞的氧化应激反应[14]。中医传统观点认为,天麻素有息风定惊、平肝益气、镇静、镇痉等作用[15]。近来研究表明其还可增加外周及冠状动脉血流量,减轻生物膜的脂质过氧化对心脏起到保护作用[16]。放射线造成心脏损伤后可导致大量氧自由基的堆积,这些氧自由基可以引起心肌细胞膜的脂质过氧化,造成心肌细胞氧化应激损伤。SOD是机体内非常重要的自由基清除剂,MDA是自由基脂质过氧化的主要代谢产物,两者水平的高低间接反映机体氧化应激水平[17]。本研究的结果同样显示,低剂量天麻素干预组小鼠心肌细胞SOD和MDA的表达较单纯对照组比较差异变化虽无统计学意义,但随着天麻素剂量的升高,中、高剂量的天麻素干预使小鼠心肌细胞SOD的活力明显增强,MDA的表达明显降低,从而减少放射损伤后心肌组织的氧化应激损伤;而且在一定范围内天麻素剂量越高,保护作用越强。

综上所述,天麻素可能通过下调心肌细胞氧化应激反应程度、减轻细胞凋亡及抗炎等来实现对RIHD的保护作用;且依据本次实验结果我们认为在一定范围内采用100 mg/kg或以上剂量干预效果更佳。但关于天麻素这一保护作用的具体分子机制还有待进一步研究阐明。

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