生物卵膜促进小鼠全层皮肤损伤修复的实验研究△

李瑾 蔡晶

(山东大学附属山东省耳鼻喉医院耳外科 济南 250022)

在耳科，很多疾病都可造成外耳道狭窄或皮肤缺损，在去除病变或行外耳道成形术中，要用到各类皮瓣或皮片来修复外耳道皮肤缺损。但由于患者供皮区有限，自体皮肤移植修复创面一直受到限制。因此，使用其他类型的皮肤替代物来促进创面愈合已成为迫切的需要。生物卵膜是一种接近生理状态的生物半透明膜，有良好的组织相容性，无毒，无免疫原性，具有杀菌、抗炎、营养保护创面和促进局部血液循环的功能。生物卵膜可促进压疮和糖尿病患者难治性创伤的恢复[1-3]。本实验以6～8周的健康雄性C57BL/6小鼠为研究对象，通过制备全层皮肤损伤创面，观察生物卵膜对小鼠皮肤损伤的修复作用，以期为将来在耳科的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性C57BL/6小鼠40只(由山东大学实验动物中心提供)，6～8周龄，体重(20±2)g，饲养于山东省耳鼻喉研究所实验动物中心SPF级屏障环境(温度20～23 ℃，湿度50%～60%)。1%戊巴比妥钠(北京冬哥科技有限公司)。

1.2 造模与分组 取40只健康雄性C57BL/6小鼠，采用1%戊巴比妥钠按40 mg/kg体重进行腹腔麻醉，备皮，75%乙醇消毒背部，标记。通过眼科剪造成3个分散分布、深及筋膜、直径2 mm、相同大小的背部皮肤缺损创面，随机分为5组，每组8只：生物卵膜组、生物卵膜+蛋清液组、莫匹多星(商品名：百多邦)组、聚维酮碘(碘伏)组和对照组。生物卵膜的制备：取新鲜鸡蛋，将其擦干，敲破蛋壳后使用无菌持物钳将鸡蛋内膜轻轻剥出。生物卵膜组在创面覆盖生物卵膜，于边角细线固定缝合1针；生物卵膜+蛋清液组是在此基础上每日涂抹新鲜蛋液于生物卵膜上方；莫匹多星组不予生物卵膜覆盖且每日早晨涂抹适量莫匹多星1次；聚维酮碘组不予生物卵膜覆盖且每日早晨涂抹适量聚维酮碘1次；对照组不予生物卵膜覆盖且不涂抹药物(图1)。每只小鼠的3个伤口确保有1个为对照，1个为生物卵膜覆盖。连续给药，单笼饲养，自由进食、饮水，每日观察并做记录，对比相同大小皮肤缺损的愈合情况。5组于造模后第6天、第12天采用Image Proplusv 1.5图像分析系统测量残余创面面积，比较各组平均愈合时间。

1.3 创面愈合时间及愈合率评价 每日观察创面愈合时间和创面愈合率。创面愈合判断标准：痂皮脱落，新上皮生成。分别于造模后第6天和第12天给创面拍照，采用Image Proplusv 1.5图像分析系统测量残余创面面积。创面愈合率=[(A1-A2)/A1]×100%，其中，A1代表原创伤面积，A2代表不同时间观察创伤面积；同时计算各组动物创面平均愈合天数。

图1. 造模与分组 A.备皮；B.制作3个伤口；C、D.不同处理措施。1伤口固定为生物卵膜覆盖；2伤口固定为生物卵膜+蛋清液干预；3伤口固定为空白对照；4伤口为莫匹多星或者聚维酮碘干预

2 结果

2.1 小鼠全层皮肤缺损创伤愈合的形态观察 小鼠全层皮肤切除创伤，肌肉组织完全暴露。由于伤到皮肤中的毛细血管，会少量出血，但很快止住。生物卵膜在创面上的覆盖时间保证在4～5 d。术后第6天，各组肉芽组织明显增多，呈深红色，可见毛细血管及创面收缩，创腔逐渐被肉芽组织填平，创缘新生上皮生长明显，创缘可见瘢痕组织形成。生物卵膜组和聚维酮碘组颜色较对照组皮肤浅，无毛发生长，创面为肉芽组织覆盖，创缘新皮较薄，透明，逐渐缩小呈瘢痕愈合。生物卵膜+蛋清液组和莫匹多星组创面较红，伴有水肿。对照组创面痂皮覆盖明显。术后第12天，对照组创面仍处于增殖修复期，新长出的表皮向创面中心爬行，逐渐覆盖创面；其余4组创面上皮化明显、收缩明显。生物卵膜组和聚维酮碘组基本愈合，瘢痕淡化，修复完全，几乎看不到创面痕迹。再次造模扩大创面为直径3 mm，亦观察到生物卵膜组较对照组创面愈合得完全且迅速。详见图2、3。

图2. 各组小鼠不同时间段皮肤创伤愈合情况(创面直径为2 mm) A～E.各组造模后第6天皮肤愈合情况；F～J.各组造模后第12天皮肤愈合情况

图3. 生物卵膜促进皮肤创伤愈合(扩大创面直径为3 mm) A、B.生物卵膜组第6天、第12天皮肤愈合情况；C、D.对照组第6天、第12天皮肤愈合情况

2.2 小鼠全层皮肤缺损创面愈合率 术后第6天，各组创面收缩，生物卵膜组和聚维酮碘组创面收缩率最为明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；生物卵膜+蛋清液组和莫匹多星组的愈合率较生物卵膜组和聚维酮碘组的愈合率低，但较对照组愈合率高(P<0.05)。术后第12天，除对照组创面尚未完全愈合，其余4组创面基本愈合。

2.3 小鼠全层皮肤缺损创面愈合时间 对照组的愈合时间为(13.38±0.52)d，生物卵膜+蛋清液组和莫匹罗星组的愈合时间较对照组略短(P<0.05)，生物卵膜组和聚维酮碘组的愈合时间最短(P<0.05)，分别为(8.25±0.46)d和(8.5±0.53)d，2组愈合时间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠创面愈合率及平均愈合时间比较()

注：a示与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

3 讨论

耳郭、外耳道常见肿瘤切除或外耳道重建术后，为避免外观畸形或耳道再次闭锁或狭窄，还应修复缺损皮肤[4]。但耳部皮肤皮下组织少，与软骨膜粘连较紧，可移动性差，尤其是一些小面积的缺损，虽看似缺损面积不大，但如直接缝合则伤口张力过大，不易愈合或局部变形，使得临床修复有一定难度[5-6]。目前常用的修复方法主要是局部转移患者耳部邻近皮瓣、断层皮片或覆盖生物材料[7-8]。若转移皮瓣，会牺牲邻近组织的正常结构，造成第2个术区，增加手术创伤和患者痛苦；若行皮片移植，存在皮片不成活或愈合不良的情况[9]；而选取一种新的修复材料一直是耳鼻喉医师关注的课题。

本研究通过建立小鼠皮肤全层缺损创面模型，发现生物卵膜对皮肤缺损愈合有促进作用。全层缺损创面可以模拟临床上常见的皮肤缺损，探索促进缺损创面愈合的治疗措施，对临床上治疗创伤、溃疡等皮肤缺损有较好的指导意义。本实验中，我们未选取耳部区域造模，是因为小鼠耳部不易固定生物卵膜，当头部活动时生物卵膜极易脱落，而背部皮肤平坦，面积较大，固定牢靠，所以选择在背部区域建模。本研究结果显示，与对照组相比，生物卵膜组和聚维酮碘组创面肉芽组织形成较早，创面收缩明显，愈合时间最短，且创面平整、瘢痕少。生物卵膜+蛋清液组的愈合时间略长，但优于对照组。蛋清液未体现修复优势可能与蛋清液使得伤口潮湿，不利于创面恢复有关。莫匹罗星组的愈合情况与生物卵膜+蛋清液组类似，莫匹罗星的抗菌效果也未见明显优势，说明抗感染在小鼠皮肤愈合过程中不是最主要的因素。

生物卵膜主要指鸡蛋壳的白色内膜，其组织修复效果主要通过以下几个方面实现：①含有多种蛋白质、氨基酸、糖类等，可使创面的营养状况得到改善，利于上皮组织细胞生长；②无毒、抗原性弱，是一种接近生理状态的半透膜，给创面营造一个微酸、低氧、相对无菌、适度湿润的微环境，是良好的天然生物性敷料；③新鲜生物卵膜含有一种溶菌酶，可以对异种生物的细胞壁起到分解作用，具备消炎、杀菌功效；④有一定的黏性、弹性和力学强度，易与创缘紧贴，可起到桥梁、支架作用，利于增生移行的上皮细胞生长[3]。

本研究中，生物卵膜组和聚维酮碘组对小鼠全层皮肤损伤修复效果相当。但这只是针对2 mm的小伤口，当伤口扩大时，生物卵膜独具优势，考虑与生物卵膜充当支架，利于上皮细胞爬行生长有关。针对小缺损，聚维酮碘的修复作用与生物卵膜相近，推测与聚维酮碘不断释放出游离碘，广谱抗微生物，促进成纤维细胞增殖，利于创面干燥有关[10]。但聚维酮碘应用偶有过敏现象出现[11]。在耳科术后，对于聚维酮碘或碘仿纱条过敏的患者，可尝试应用生物卵膜贴敷来替换碘仿纱条+植皮。生物卵膜作为鼓膜贴补材料可以明显提高鼓膜穿孔的愈合率已经有许多报道[5]。尽管小鼠皮肤和人的皮肤存在差别，生物卵膜的疗效在临床中需进一步验证，但本实验中生物卵膜可以明显促进创面愈合速度，切实为临床皮肤损伤修复提供新的治疗方法。