水翁花对过氧化氢诱导神经细胞凋亡的影响

2019-11-30于广周谭文刚张昊

分子诊断与治疗杂志 2019年6期

于广周谭文刚张昊

阿尔茨海默病属于退行性神经系统病变，并严重危害老年人健康，既往研究显示氧化应激可促进退行性神经系统病变发生［1-2］。因而寻找具有清除氧自由基活性的药物对降低退行性神经系统病变发生率具有重要意义。研究表明水翁花对过氧化氢（H2O2）诱导的神经细胞损伤具有保护作用［3-4］。但水翁花对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护机制尚未完全阐明。研究表明H2O2诱导PC12细胞中微小RNA-422a（microRNA-422a，miR-422a）与bcl-w蛋白表达呈负相关，miR-422a可能通过负向调控bcl-w表达而参与H2O2诱导的PC12细胞凋亡过程［5］。基于水翁花对神经系统具有较好的保护作用，本研究采用H2O2诱导PC12细胞损伤模型，探讨水翁花对miR-422a表达及神经细胞凋亡的影响，分析其可能作用机制，旨在为临床治疗退行性神经系统病变提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PC12细胞购自上海中国科学院上海生化细胞所。水翁花购自安徽广印堂中药股份有限公司，经实验室鉴定为桃金娘科植物水翁的干燥花蕾。RPMI 1640培养基与胎牛血清均购自美国Gibco公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；30%过氧化氢（H2O2）购自天津富宇试剂有限公司；PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax多克隆抗体均购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；miR-422a mimics及阴性对照（miR-NC）、miR-422a抑制物（anti-miR-422a）及阴性对照（anti-miR-NC）均购自上海吉玛制药技术有限公司；Trizol、逆转录及实时荧光定量PCR（qRTPCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药物处理与实验分组

用不同浓度（100、200、300 nmol/L）的 H2O2处理PC12细胞，通过检测PC12细胞凋亡率筛选适宜浓度构建H2O2模型。实验分组：PC12组（正常对照组）、H2O2模型组（300 nmol/L）、水翁花干预组（10、20、40、60 mg/L），PC12细胞培养于含有 10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养24 h，除PC12组、H2O2模型组外，其余各组加入相应药物浓度处理12 h，除PC12组外，其余各组加入相同浓度的H2O2处理12 h。后续实验中又将H2O2模型组PC12细胞分为miR-NC组（转染miR-422a mimics阴性对照培养12 h）、miR-422a组（转染miR-422a mimics培养12 h）、水翁花40 mg/L+anti-miR-NC组（转染阴性对照后使用浓度为40 mg/L的水翁花处理12 h）、水翁花40 mg/L+anti-miR-422a组（转染miR-422a抑制物后使用浓度为40 mg/L的水翁花处理12 h），收集各组转染成功的细胞，使用浓度为300 nmol/L的H2O2处理12 h。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

弃旧培养基，用2 mL预冷PBS洗涤各组对数生长期PC12细胞，胰蛋白酶消化细胞，收集细胞置于无菌无酶的EP管内，4℃条件下，1 000 r/min转速离心5 min，弃上清，加入1 mL生理盐水制备细胞悬液，4℃条件下，1 000 r/min转速离心5 min，加入缓冲液，加入 5 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，加入5 μL PI，室温避光染色5 min，于1 h内上机，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3 检测SOD活性

收集各组细胞，4℃条件下，1 000 r/min转速离心5 min，用PBS洗涤3次，加入预冷细胞裂解液，冰上裂解 10 min，4℃条件下，12 000 r/min转速离心5 min，吸取上清，按照试剂盒说明书检测细胞SOD活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测Bcl-2、Bax蛋白表达

取对数生长期PC12细胞，加入预冷细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃条件下，12 000 r/min转速离心10 min，吸取上清（细胞总蛋白），采用BCA法检测蛋白浓度，高温条件下使蛋白变性，取20 μg蛋白样品上样，经12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳结束后将分离蛋白凝胶转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入相关一抗（稀释比 1∶1 000）于 4℃封闭 24 h，TBST洗膜，再加入二抗（稀释比1∶5 000）封闭1 h，加入ECL发光显影，置于凝胶成像系统曝光成像，采用Quantityone软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

1.2.5 qRT-PCR检测细胞中miR-422a表达水平

采用Trizol法提取PC12细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度，按照逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，严格按照qRT-PCR检测试剂盒说明书配反应体系，反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，ddH2O26 μL。反应条件：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性 15 qs，60℃退火 60 s，72℃延伸 30 s，共循环40次，放入ABI 7500实时荧光定量PCR仪检测miR-422a相对表达量。

1.3 统计学处理

应用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料均符合正态分布，数据均以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2诱导神经细胞PC12损伤

与PC12组相比，PC12+H2O2100 nmol/L组、PC12+H2O2200 nmol/L组、PC12+H2O2300 nmol/L组PC12细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），SOD活性显著降低（P＜0.05），差异有统计学意义，见表1、图1。由于PC12+H2O2300 nmol/L组PC12细胞凋亡率较高，因此选取选用H2O2300 nmol/L构建损伤模型，用于后续实验研究。

表1 H2O2诱导神经细胞PC12损伤（±s，n=6）Table 1 Hydrogen peroxide induces PC12 damage in neurons（±s，n=6）

与PC12组比较，aP＜0.05。

分组PC12 PC12+H2O2100 nmol/L PC12+H2O2200 nmol/L PC12+H2O2300 nmol/L F值P值SOD(U/mL)17.72±1.68 14.95±1.34a 10.02±1.00a 6.72±0.58a 97.706 0.000凋亡率（%）7.58±0.52 11.23±1.20a 17.21±1.76a 55.78±4.33a 504.091 0.000

图1 不同浓度的H2O2对神经细胞PC12凋亡的影响Figure1 Effects of different concentrations of hydrogen peroxide on apoptosis of PC12 neurons

2.2 水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡及SOD表达的影响

用不同浓度的水翁花处理PC12细胞后使用H2O2（300 nmol/L）干预细胞，结果显示，与对照组相比，PC12细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），SOD活性显著增强（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达量显著升高（P＜0.05），而 Bax蛋白表达量显著降低（P＜0.05），且随着使用剂量的增加而变化（P＜0.05），呈剂量效应，见图2、表2。表明水翁花可抑制H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡，并可减轻氧化应激反应程度。选用水翁花（40 mg/L）进行后续实验。

2.3 水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12中miR-422a表达的影响

qRT-PCR检测结果显示，与PC12组相比，PC12+H2O2300 nmol/L组PC12细胞中miR-422a的表达水平显著降低（P＜0.05）；相对于PC12+H2O2300 nmol/L组，PC12+H2O2300 nmol/L+水翁花40 mg/L组PC12细胞中miR-422a的表达水平显著升高（P＜0.05），见表3。

图2 水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡蛋白表达的影响Figure 2 Effects of Pulsatilla chinensis on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

表2 水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡及SOD表达的影响（±s，n=6）Table 2 Effects of Herba Anemoniae on Apoptosis and SOD Expression of PC12 Neurons Induced by H2O2（±s，n=6）

与对照组比较，aP＜0.05；与水翁花 10 mg/L 组比较，bP＜0.05；与水翁花20 mg/L组比较，cP＜0.05。

分组（mg/L）对照水翁花10水翁花20水翁花40水翁花60 F值P值SOD（U/mL）6.71±0.54 9.66±0.84a 12.01±1.12ab 15.62±1.37abc 16.23±1.41abc 79.023 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.45±0.04a 0.58±0.06ab 0.76±0.08abc 0.82±0.08abc 82.984 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.94±0.09a 0.71±0.07ab 0.43±0.04abc 0.37±0.04abc 125.961 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 33.93±3.24a 24.81±2.56ab 12.26±1.13abc 10.25±1.01abc 227.141 0.000

表3 水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12中miR-422a表达的影响（±s，n=6）Table 3 The effect of Herba Pulsatillae on the expression of microRNA-422a in neuron PC12 induced by H2O2（±s，n=6）

分组PC12 PC12+H2O2300 nmol/L PC12+H2O2300 nmol/L+水翁花40 mg/L F值P值miR-422a 1.12±0.11 0.12±0.01a 0.83±0.08b 256.161 0.000

2.4 过表达miR-422a对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡及SOD活性的影响

结果显示，与miR-NC组相比，miR-422a组PC12细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），SOD活性显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达量显著增加（P＜0.05），而Bax蛋白表达量显著降低（P＜0.05），见图3、表4。

2.5 抑制miR-422a表达能逆转水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡、SOD活性的影响

相对于水翁花40 mg/L+anti-miR-NC组，水翁花40 mg/L+anti-miR-422a组PC12细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），SOD活性与Bcl-2蛋白表达量均显著降低（P＜0.05），Bax蛋白表达量显著升高（P＜0.05），见图4、表5。表明抑制miR-422a表达可逆转水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡、SOD活性的影响。

图3 过表达miR-422a对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡蛋白表达的影响Figure 3 Effects of overexpression of microRNA-422a on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

表4 过表达miR-422a对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡及SOD活性的影响（±s，n=6）Table 4 Effect of over-expression of microRNA-422a in on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

与miR-NC组比较，aP＜0.05。

分组miR-NC miR-422a t值P值SOD（U/mL）6.71±0.54 14.37±1.28a 13.506 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.65±0.06a 14.241 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.53±0.05a 13.190 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 19.71±1.58a 16.815 0.000

图4 抑制miR-422a表达能逆转水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡蛋白表达的影响Figure 4 Inhibiting the expression of miR-422a reverses the effect of Saussurea chinensis on apoptotic protein expression of PC12 induced by hydrogen peroxide in nerve cells

3 讨论

PC12细胞源自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，其结构、功能及形态均与神经细胞相似可被用于神经药理学方面的研究，H2O2诱导PC12细胞损伤是氧化应激损伤的经典模型，研究表明活性氧介导的氧化应激损伤在神经退行性疾病中发挥重要作用，而机体内代谢产生的H2O2相当于活性氧，可加重机体氧化应激损伤［6-7］。天然生产药物对清除自由基活性及保护细胞免受氧化损伤已成为研究热点［8］。因此，本研究拟寻找减轻神经细胞氧化损伤的药物，并探究其可能作用机制。

表5 抑制miR-422a表达能逆转水翁花对H2O2诱导的神经细胞PC12凋亡、SOD活性的影响（±s，n=6）Table 5 Inhibits the expression of microRNA-422a and reverses the effects of Saussurea chinensis on apoptosis and SOD activity of PC12 neurons induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

与对照组比较，aP＜0.05；与水翁花40 mg/L+anti-miR-NC组比较，bP＜0.05。

分组对照水翁花40 mg/L水翁花40 mg/L+anti-miR-NC水翁花40 mg/L+anti-miR-422a F值P值miR-422a 0.12±0.01 0.83±0.08a 0.84±0.08 0.57±0.06b 165.527 0.000 SOD（U/mL）6.71±0.54 15.62±1.37a 15.84±1.41 9.67±0.99b 95.402 0.000 Bcl-2蛋白0.26±0.03 0.76±0.08a 0.75±0.07 0.48±0.05b 93.864 0.000 Bax蛋白1.23±0.12 0.43±0.04a 0.42±0.04 0.89±0.09b 143.525 0.000凋亡率（%）52.58±4.52 12.26±1.13a 12.19±1.16 22.82±2.22b 312.153 0.000

水翁花属于广东地产药材，具有解暑、清热解毒、抗炎、阵痛等功效［9］。研究表明水翁花提取物可抑制脂肪酶等生成，还具有抗高血压、白内障、神经细胞氧化损伤等多种功能［10-11］。本研究采用不同浓度的H2O2诱导PC12细胞，结果发现H2O2300 nmol/L时细胞凋亡率较高，因而选取H2O2300 nmol/L构建神经细胞损伤模型。用不同浓度的水翁花处理H2O2诱导PC12细胞，结果发现细胞凋亡率降低，Bcl-2表达下调，而Bax表达上调，H2O2可破坏细胞或线粒体膜性结构而促进细胞凋亡，而线粒体在细胞凋亡过程中发挥重要作用，研究表明Bcl-2可抑制凋亡蛋白参与凋亡途径，Bcl-2/Bax比值降低细胞趋向凋亡［12-13］。本研究结果提示水翁花可通过降低Bax表达表达及升高Bcl-2表达而抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡。SOD属于机体内自由基清除系统，其可清除机体氧化应激产生的MDA等过氧化物［14］。本研究结果表明H2O2可降低自由基清除系统的活力而诱导细胞凋亡，水翁花可增强SOD活性，抑制神经细胞凋亡从而发挥抗细胞凋亡作用。

miR-422a是脑组织中特异性miRNA，其可作为缺血性脑卒中、动脉粥样硬化等疾病的诊断标志物，还可通过调控细胞凋亡而参与该疾病发生及发展过程［15-16］。本研究结果表明H2O2诱导的PC12细胞中miR-422a表达水平降低，而水翁花可上调miR-422a表达，进一步研究显示上调miR-422a表达对H2O2诱导PC12细胞凋亡具有抑制作用，并可增强SOD活性。同时本研究结果表明抑制miR-422a表达可逆转水翁花对H2O2诱导的PC12细胞凋亡及SOD活性的作用。提示水翁花对神经细胞具有积极调控作用，并可抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，其可能通过上调miR-422a表达而发挥作用。

综上所述，水翁花可通过上调miR-422a表达而减轻H2O2诱导的神经细胞凋亡，并增强机体抗氧化能力，为临床进一步应用水翁花防治氧化应激导致的神经系统退行性疾病提供理论依据。但关于miR-422a下游靶基因及其相关信号通路的关系仍需深入研究。