基于分子标签二代测序技术的非小细胞肺癌驱动基因变异分析

刘小云 吴小延 邵琼 龙亚康 王海云 邓玲

肺癌是世界上发病率和死亡人数较高的恶性肿瘤。肺癌主要分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）两大类，其中，NSCLC占85%以上。早期的NSCLC治疗主要选择手术，但多数NSCLC患者初诊时已是中晚期，不适于手术，只能选择以药物治疗为主［1］。随着精准医疗和分子诊断技术的发展，靶向治疗使NSCLC的治疗朝着更加精准的方向发展［2-4］。近年来，多项研究致力于评估液体活检应用的可能性［5-6］。液体活检分析的肿瘤生物标志物包括血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）、循环肿瘤细胞、外泌体等。

cfDNA和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）都是血液生物标志物，cfDNA是癌细胞和正常细胞凋亡后释放入外周血的DNA片段，ctDNA是肿瘤细胞破裂后释放入外周血的DNA片段。血浆cfDNA基因检测可用于识别靶向药物靶点、评估治疗反应、监测耐药性、检测肿瘤残留病灶等［7-8］。目前，NSCLC常见的驱动基因包括 EGFR、ALK、ROS1、KRAS、ERBB2、RET、PIK3CA、BRAF 等［9］。对于携带相应基因敏感突变的NSCLC患者，采用靶向药物治疗可以显著延长患者的生存期，改善患者的生存质量。因此，对于初诊患者可以检测基因突变情况，确定精准的治疗方案。对于已采用靶向治疗患者，需要监测患者耐药突变情况，以及时改进治疗方案。

本实验针对血浆ctDNA标本采用基于分子标签的高通量二代测序技术，分析NSCLC患者的相关驱动基因突变情况，评估血浆ctDNA二代测序技术用于指导靶向用药及进展后耐药监测的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究经中山大学附属肿瘤医院医院伦理学委员会批准，患者知情同意。共纳入163例2017年7月至2019年7月期间在中山大学附属肿瘤医院就诊的NSCLC患者的血液标本，其中男性97例（59.5%），女性66例（40.5%）。患者年龄28～88岁，其中60岁以上90例（55.2%），60岁以下73例（44.8%）。无吸烟史57例（35.0%），有吸烟史42例（25.8%），情况不明64例（39.2%）。肺腺癌130例（79.8%），肺鳞癌 8例（5.0%），分型不明 25例（15.2%）。临床分期为Ⅰ～Ⅱ期的33例（20.2%），Ⅲ～Ⅳ期的101例（62.0%），分期不明的29例（17.8%）。

1.2 血浆游离肿瘤DNA提取及石蜡包埋组织DNA提取

采集10 mL外周血样品至EDTA抗凝管。为避免血浆cfDNA被血细胞溶解释放的基因组DNA污染，抽取的外周血样品需在4℃下保存并于2 h内进行血浆分离。采用2次离心法分离血浆。先将10 mL血液样品在4℃，1 600 g条件下离心15 min。吸取上清，将上清置4℃，16 000 g条件下离心15 min。吸取上清至新的1.5 mL离心管中。利用血浆用比色卡进行比色，评估血液的溶血程度。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid extract kit（Qiagen）提取样品中的cfDNA。石蜡包埋组织DNA 使用 QIAamp DNA FFPE Tissue Kits（Qiagen公司）进行提取。提取后的ctDNA及肿瘤组织DNA样本均使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）进行定量分析。

1.3 组织样本ARMS-PCR检测

利用组织样本ARMS-PCR检测试剂盒（人EGFR基因突变检测试剂盒，金菩嘉）对组织样本的EGFR突变情况进行检测。实验操作按照试剂盒说明进行操作。该试剂盒可对突变体DNA含量＞1%的样本品实现稳定检测。检测覆盖EGFR基因18、19、21号外显子36个EGFR-TKI敏感突变位点，20号外显子包括T790M、S768I、插入突变等9个耐药突变位点。

1.4 高通量捕获测序

利用血清/血浆游离DNA高通量测序试剂盒（思路迪）对cfDNA样品进行二代测序文库构建、捕获，包括建库和目标区域捕获。ctDNA的投入量为60 ng，最低不低于30 ng。目标区域捕获采用150基因panel进行捕获。实验操作按照试剂盒（血清/血浆游离DNA高通量测序试剂盒，思路迪）说明进行操作。将捕获的DNA片段于Illumina NextSeq500测序仪（Illumina）上测序，选用双端75 bp测序模式。血浆ctDNA测序深度要求为平均测序深度大于10 000X，有效测序深度大于2 000X。

1.5 血浆ctDNA二代测序数据分析

Illumina NextSeq500测序仪（Illumina）产生的下机数据为bcl格式文件，使用bcl2fastq Conversion Software（Illumina）将 bcl格式文件转换为fastq格式的文件。获取拆分的原始测序数据后，首先利用BWA MEM［10］将测序序列比对到参考人类基因组上（hg19），比对软件参数设置为默认。比对结果处理步骤包括利用fgbio软件，根据基因组比对信息和分子标签信息，将来源于同一条DNA片段的序列（reads）分类为一组，生成一致性序列（consensus reads）。利用BWA MEM将生成的consensus reads比对到参考人类基因组上。基于比对后的测序数据，统计各个样本原始下机数据量、捕获区域原始测序深度、捕获区域有效测序深度、捕获上靶率、reads比对成功率、捕获区域95%位点达标有效深度等质控信息。基于去重后的比对结果，完成单碱基替换类型位点和短片段插入/缺失的查找。进一步基于背景测序错误率估计、正常人cfDNA背景模型、变异的正负链平衡、变异位点在被检测序列中出现的位置以及变异位点是否由平台系统错误造成等条件完成过滤，保留高可信度的体细胞变异。完成所有高可信度变异的注释，并过滤去除所有良性变异位点。

2 结果

2.1 初诊初治NSCLC ctDNA驱动基因突变谱

共纳入98例初诊初治的NSCLC患者，其中肺腺癌73例，肺鳞癌8例，其他17例分型不明。98例初诊初治的NSCLC患者中11个驱动基因的详细突变信息见图2，包括单碱基突变、小片段插入缺失、融合突变、拷贝数扩增4种突变类型。图中每列代表一例患者中11个驱动基因的突变情况，每行代表一个基因在98例患者中的突变情况，图中也展示了98例患者的性别、年龄、肿瘤分型、临床分期、吸烟史情况，上方条形图统计了每例样本中11个驱动基因的突变个数，右方条形图统计了每个基因在98例患者中的突变频数。其中，37例（37.8%）患者未检出肺癌驱动基因突变。其余患者中 TP53、EGFR、ERBB2、RET、KRAS、ALK、PIK3CA、BRAF、MET、ROS1、NRAS的突变频率分别为33%、24%、10%、8%、7%、6%、4%、3%、3%、3%和1%（见图2）。TP53基因突变是NSCLC患者中检出率最高的，其突变在各功能域的分布，见图1。23例（24%）EGFR突变患者中，最为常见的为L858R突变（34.8%，8例）和19号外显子缺失突变（26.1%，6例），2例（8.7%）检出20号外显子插入突变，1例（4.3%）检出EGFR拷贝数扩增，1例（4.3%）检出EGFR A864V、E746_A750del和EGFR拷贝数扩增3种突变，其他突变包括 K757R、A613T、A647T、T678M、L833V+H835L（21.7%，5例），EGFR详细突变信息见图1（不包括EGFR拷贝数扩增）。7例患者（7.0%）检出KRAS突变，1例为KRAS拷贝数扩增，其他6例检出2号外显子突变（5例G12V/C/R突变，1例G13D突变）。ALK融合在3例患者中被检测，均为ALK-EML4融合。3例患者检出ERBB2 Y772_A775dup突变。在1例患者中检出NRAS G12D突变。

2.2 EGFR-TKI靶向治疗进展后耐药突变

图1 TP53基因和EGFR基因突变功能域分布Figure 1 Mutation distribution in the functional domains of TP53 and EGFR

图2 98例初诊初治NSCLC患者突变谱分布热图Figure 2 The mutation spectrum of 98 patients with tyrosine kinase inhibitor（TKI）-naïve non-small cell lung cancers

共有65例接受一代、二代或三代EGFR-TKI靶向治疗的NSCLC患者，其中57例患者接受EGFR-TKI治疗后进展，8例未出现进展，未纳入进展后耐药突变分析。57例治疗后进展的患者中，42例接受一代TKI治疗，1例接受二代TKI治疗，1例接受三代TKI治疗，3例接受一代TKI治疗后改用二代TKI治疗，10例接受一代TKI治疗后改用三代TKI治疗。21例（36.8%）接受EGFR-TKI治疗后进展的患者检出T790M耐药突变。共11例患者接受三代TKI靶向药治疗，其中3例（27.3%）进展患者出现T790M与T797S顺式耐药突变。其他耐药突变包括KRAS基因突变（2例）、MET基因扩增（1例）以及PIK3CA基因突变（8例）。11个NSCLC驱动基因在各EGFRTKI靶向治疗后进展患者中的突变分布情况，见图3。

图3 一代、二代、三代EGFR-TKI靶向治疗进展后耐药突变分布Figure 3 Resistance mutation distribution in 57 EGFR-TKI relapsed patients

2.3 ARMS-PCR组织EGFR突变检测与NGS ctDNA EGFR突变检测结果对比

在纳入的163例NSCLC患者中，29例患者存在配对的组织样本ARMS-PCR检测结果。29例患者均为组织样本检测结果为EGFR突变阳性，包括13例检出EGFR基因19号外显子缺失突变，15例检出EGFR基因L858R突变，1例检出EGFR基因20号外显子错义突变。29例NSCLC患者中，18例患者的临床分期为Ⅰ～Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期患者为4例，7例患者的临床分期为不详。29例患者的病理分型均为肺腺癌，3例患者肿瘤直径＞5 cm，其余患者肿瘤大小均不超过3 cm。4例患者ctDNA二代测序方法检出EGFR突变（1例K757R、1例L858R、1例E746_A750del、1例L858R合并V834L突变）（见图4）。采用ctDNA二代测序方法检出EGFR突变的4例患者中，3例肿瘤大小＞5 cm，3例临床分期为Ⅲ～Ⅳ期，1例分期为Ⅰ期。

3 讨论

图4ARMS-PCR组织EGFR突变与NGS ctDNA EGFR突变检测结果对比Figure 4 The comparison between EGFR mutations in tissues by ARMS-PCR and in plasma by NGS

近年来，随着精准医疗成为关注的热点，NSCLC驱动基因相关研究也取得了巨大进展。特别是二代测序技术的广泛应用，使得NSCLC治疗由标准化的治疗方法向基于基因突变的靶向治疗方法转变。EGFR基因突变是NSCLC患者最常见的突变之一，目前常用的EGFR靶向治疗药物包括一代/二代/三代TKI。同时，一代/二代EGFR-TKI靶向用药的最常见耐药机制为EGFR T790M突变。目前，临床上基因突变检测的金标准是肿瘤组织检测，但由于肿瘤组织取材限制、肿瘤的异质性、难于采用肿瘤组织动态监测靶向用药后基因变异状况等［11-12］，液体活检作为一种无创、易取样、利于动态监测的检测方法，对于指导靶向治疗具有极大应用前景。纳入163例NSCLC患者，分析了NSCLC相关的11个驱动基因的突变情况。根据结果分析，ctDNA用于初诊初治NSCLC驱动基因突变检测和NSCLC靶向治疗耐药突变情况检测可能存在以下问题。

首先，采用ctDNA二代测序方法检测NSCLC EGFR突变的检出率为24%，低于文献报道的亚洲人群中EGFR突变率［13］。由于纳入的初诊初治NSCLC患者中，早期肺癌患者有33例，临床分期不详患者17例，而血液中ctDNA含量与肿瘤分期或肿瘤负荷有关，导致突变的检出率低于文献报道的检出率。其次，早期肿瘤患者cfDNA中ctDNA含量可能低于1%［14］，正常组织释放的cfDNA对肿瘤细胞释放的ctDNA具有稀释作用，导致检测结果不可避免的出现假阴性的情况。因此，对于初诊初治患者，需要根据患者的肿瘤分期或肿瘤负荷情况来确定是否选择ctDNA检测。在ctDNA检测结果为阴性时，需要考虑假阴性的情况，仍需建议患者以肿瘤组织检测作为治疗依据。

EGFR T790M突变是一代/二代EGFR-TKI靶向治疗进展耐药的最常见机制，可在50%以上的耐药患者中检出此突变［15-16］。靶向治疗后耐药进展的患者中，T790M突变的检出率为36.8%，低于文献中报道的突变率。由于部分耐药进展患者在ctDNA基因检测前接受过化疗，导致本次ctDNA突变检测结果可能并不能够代表患者真实的耐药分子机制。进而导致T790M的检出率低于文献中报告的检出率。因此，采用ctDNA二代测序方法监测患者耐药情况时，需要对患者采血时间精准把控。采用ctDNA二代测序方法监测耐药情况的优势在于，相比于肿瘤组织，血浆cfDNA基因检测可以及时有效的监测治疗过程中耐药突变情况，且抽血过程相对无创，患者能够接受多次采样，容易实现对治疗反应的动态监测。目前，多项研究开发了针对低丰度变异的二代测序检测技术［17-20］，以在体内正常cfDNA的背景噪音中检测这些罕见的ctDNA变异。

组织EGFR突变阳性患者与ctDNA检测EGFR阳性患者之间的一致性仅为13.8%。对29例患者的临床分期及肿瘤大小分析发现，仅4例为Ⅲ～Ⅳ期，7例患者的临床分期为不详，仅3例患者肿瘤直径＞3 cm，其余患者肿瘤直径均不超过3 cm。根据文献报道，早期肿瘤患者和肿瘤直径小于3 cm的肿瘤患者中基因突变的检出率相对较低［21-22］。基于一致性结果，对于早期肿瘤患者需要进行基因检测指导靶向治疗时，选择样本类型时需谨慎，仍需选择肿瘤组织作为检测的金标准，避免采用血浆ctDNA检测出现假阴性的情况，耽误患者治疗。

综上所述，虽然对于早期NSCLC患者或者肿瘤负荷较低的患者，二代测序检测血浆ctDNA存在假阴性的可能，但此方法不仅能够检出初诊初治NSCLC患者中靶向治疗的敏感突变，还可以对靶向治疗进展后的耐药突变情况进行监测。采用的基于分子标签的二代测序方法，能够减少建库操作和测序过程中产生的错误，用于血浆ctDNA基因突变检测时可提高真实突变的检出。因此，在对抽血对象的肿瘤分期和肿瘤负荷、患者治疗情况以及抽血时间点进行严格把控的条件下，可选择基于分子标签的二代测序检测技术来指导NSCLC患者的个性化用药。