Snail基因甲基化与TGFβ1诱导前列腺癌细胞发生EMT的相关性研究

杜彦丹 牛艺卿 郑海军 王晓艳 姜玉海 陈海秋 李寅雁 孙刚李春雨 陆德生 孙辉★

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是中老年男性常见的一种恶性肿瘤，中国PCa发病率明显低于欧洲国家，随着人口老龄化及生活水平的提高，正呈现逐年升高的趋势。PCa中腺泡腺癌占95%以上，通称为PCa［1］，其不是一种独立疾病，能够侵袭转移至膀胱、血管神经束、精囊，从而引起全身系统的病理生理改变。大量研究显示，前列腺癌的发生、转移与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal-transition，EMT）密不可分［2-3］，它与表观遗传修饰在肿瘤侵袭-转移级联过程中发挥着重要作用。微环境中的转化生长因子 β1（transforming growth foctor β1，TGFβ1）由基质细胞分泌，其信号通路下游SMAD磷酸化，可进一步激活转录因子启动EMT过程［4］。有研究表明具有锌指结构的转录因子Snail1参与EMT的发生，多种转移及复发的上皮细胞肿瘤中均有Snail1的高表达［5-6］，这可能与Snail1转录因子启动子区组蛋白甲基化修饰有关。赖氨酸及精氨酸甲基化多发生在组蛋白H3各位点［7］，其中H3K9甲基化是特殊染色质形成和基因转录沉默的表观遗传标志，可以抑制基因转录，其去甲基化酶KDM4A参与催化去除H3K9甲基化过程。本课题旨在通过沉默KDM4A表达，改变Snail1甲基化富集程度，观察PC3细胞形态学变化及Snail1的表达变化，阐明前列腺癌发生EMT的重要机理。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

人前列腺癌PC3、DU145细胞株购自ATCC公司。胎牛血清、1640培养液、胰酶购自Gibco公司；DMSO购自美国Sigma公司；Trizol为荷兰Invitrogen公司产品；DNA Marker为TakaRa公司产品；所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成；BCA蛋白定量试剂购自美国Thermo公司，所有抗体均为美国Cell Signaling公司生产；免疫组化试剂来源于上海McLean公司。

1.2 细胞实验

1.2.1 形态学观察

当细胞生长至90%汇合时，无血清饥饿细胞24 h，0.5%FBS的1640培养基中添加10和20 ng/mL TGFβ1处理细胞 24、48 h，使用荧光显微镜对细胞形态的改变进行观察和记录。

1.2.2 细胞划痕（迁移）实验

培养皿下画线、铺板并培养细胞至贴壁。给药后，无血清饥饿培养。待细胞生长至80%，垂直于六孔板的底部直线划线，按照不同时间段及给药浓度留取图片并分析结果。

1.2.3 细胞侵袭（Transwell）实验

Transwell小室内平铺100 μL基质胶，小室下加入500 μL 1640培养基，放入小室时避免产生气泡。小室内吸入100 μL无血清细胞悬液，孵育24、48 h，固定、结晶紫染色后分析结果。

1.3 RT-PCR检测人前列腺癌细胞株中EMT相关maker的变化

处理方法如1.2.1，Trizol法提取细胞总RNA，取 A260/A280比值落于 1.8～2.0之间的RNA进行实验，取1 μg逆转录合成cDNA。以cDNA序列为模板，选用的内参基因为GAPDH，扩增后按以下计算方法分析数据：2-△△Ct=2［（Ct目的基因-Ct内参基因）待测样本-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照样本］。

1.4 Western Blot检测人前列腺癌细胞株中EMT相关maker的变化

取对数生长期的前列腺癌细胞，PBS洗涤后加入细胞变性裂解液，煮沸、离心、取上清液，加入蛋白loading buffer，检测蛋白浓度。取上样量40 g的蛋白，以β-actin作为参照，进行12%SDS-PAGE电泳，随后进行转膜、封闭、抗原抗体反应及发光显影，使用与β-actin的比值表示各组蛋白表达水平。

1.5 免疫组化实验

收集内蒙古林业总医院病理科前列腺良性增生组织（对照组）及Gleason分级4级以上的前列腺癌组织（实验组）各60例。将标本依次进行固定、包埋及切片；置于新鲜二甲苯中浸泡，沥干后按顺序放入无水乙醇、90%乙醇及75%乙醇中；蒸馏水冲洗1 min，放入PBS缓冲液中；组化染色后观察组织片，分析结果。

1.6 统计学分析

以上实验均有效重复三次以上，数据用（x±s）表示，使用SPSS 22.0软件中方差分析来处理实验结果。P＜0.05或P＜0.01差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 TGFβ1诱导后前列腺癌细胞系形态学及EMT相关Marker变化

培养人前列腺癌PC3和DU145细胞，观察TGFβ1诱导后细胞形态变化、细胞迁移和侵袭试验结果。利用Western blot和RT-PCR技术检测细胞发生EMT时相关Marker的表达变化。

2.1.1 前列腺癌PC3细胞形态学变化

按照1.2.1处理细胞后，在光学显微镜下观察细胞形态学改变，结果显示：PC3和DU145细胞均由椭圆形变为长梭型（图1 A、B），其中PC3细胞形态变化较明显，课题组筛选出PC3细胞进行后续实验（图2A、B）。划痕和Transwell侵袭实验结果表明：TGFβ1诱导PC3细胞后，细胞的迁移和侵袭能力增强（图3、4）。

2.1.2 RT-PCR和Western blot检测PC3细胞EMT相关Marker表达的变化

TGFβ1诱导PC3细胞，EMT相关Marker表达发生改变，E-cadherin表达下调，Snail1和Vimentin表达上调，其中Snail1表达变化最显著（图5）；Western blot结果也显示Snail1的表达量显著增高。（图6、7）。

图1 DU145细胞经TGFβ1诱导24、48 h后光学显微镜下形态学的变化Figure 1 Morphological changes of DU145 cells induced by TGFβ1 for 24 and 48 hours under optical microscope

图2 PC3细胞经TGFβ1诱导24、48 h后光学显微镜下形态学的变化Figure 2 Morphological changes of PC3 cells induced by TGFβ1 for 24 and 48 hours under optical microscope

图3 PC3细胞经20 ng/mLTGFβ1处理24、48 h后，细胞划痕实验结果Figure 3 Scratch test results of PC3 cells treated with 20 ng/mL TGFβ1 for 24 and 48 hours

图4 PC3细胞Transwell实验结果Figure 4 Transwell experiment results of PC3 cells

图5 TGFβ1诱导PC3细胞，EMT相关Marker mRNA水平的变化Figure 5 mRNA changes of EMT-related Marker in PC3 cells induced by TGFβ1

图6 TGFβ1诱导PC3细胞24 h后相关蛋白的表达Figure 6 Expression of related proteins in PC3 cells induced by TGFβ1 for 24 hours

图7 TGFβ1诱导PC3细胞48 h后相关蛋白的表达Figure 7 Expression of related proteins in PC3 cells induced by TGFβ1 for 48 hours

2.2 前列腺良性增生组织及前列腺癌组织中EMT相关Marker的表达结果

对照组及实验组组织标本免疫组化结果显示：对照组中E-cadherin细胞膜表达呈强阳性，Vimentin、Snail细胞质表达呈弱阳性，见图8A；实验组中E-cadherin细胞膜表达弱阳性，Vimentin、Snail细胞质表达强阳性，见图8B。可见组织病理学层面Snail在前列腺癌的发生发展过程中也起了决定性作用。

2.3 沉默KDM4A，PC3细胞形态学及转录因子Snail1表达的变化

培养前列腺癌PC3细胞，进行TGFβ1及TGFβ1+siKDM4A处理。20 ng/mL TGFβ1诱导的同时，沉默组蛋白去甲基化酶KDM4A的表达，Snail1甲基化程度发生改变，抑制了EMT的进程，前列腺癌PC3细胞由间质形转变为上皮形态（图9），间质marker Snail1表达下调（图10）。

图8 前列腺良性增生和前列腺癌组织免疫组化结果Figure 8 Immunohistochemical results of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer

图9 沉默KDM4A后PC3细胞形态学变化（40×）Figure 9 Morphological changes of PC3 cells after silencing KDM4A

图10 沉默KDM4A后Snail1表达变化Figure 10 Changes of Snail1 expression after silencing KDM4A

3 讨论

肿瘤转移与表观遗传修饰密切相关，重要修饰包括组蛋白甲基化、泛素化、乙酰化和染色质重塑［8］。EMT发生期间，上皮标志物E-cadherin启动子区域高甲基化是一例常见的表观遗传修饰事件［9］，可引发E-钙粘蛋白沉默。一些报道也称EMT其它相关转录因子Snail，Slug等启动子区域甲基化与其表达相关［10］，可能主要因EMT相关转录因子Snail、ZEB1和ZEB2能够募集HDAC复合物，发生EMT时使E-cadherin表达沉默［11］。

目前，组蛋白修饰是表观遗传学研究的重要领域［12］，其中以组蛋白H3各位点的乙酰化，甲基化及泛素化等最为常见和多变［13］。相关报道指出组蛋白H3各位点乙酰化修饰一般均和染色质的开放程度有关，H3乙酰化可以诱导染色质结构松散，促进基因转录，而甲基化修饰的结果则取决于基因组的不同功能［14-15］。组蛋白H3甲基化中H3 K4和H3K36甲基化修饰可激活基因转录，H3K9甲基化可导致特殊染色质的形成，抑制基因转录。有研究证实H3K9ME3基因上游和基因组富集与染色质开放和基因转录水平呈负相关［16-17］，本课题的研究结论与其一致。

赖氨酸甲基化是调节染色质结构的一种常见组蛋白修饰。癌症发展进程中，组蛋白赖氨酸甲基化显著改变，被认为是由不受控制的组蛋白赖氨酸甲基转移酶或组蛋白去甲基化酶作用的结果［18-19］。KDM4 是一种组蛋白去甲基酶［20］，主要针对赖氨酸9/36位置上的组蛋白H3和赖氨酸26位置上的组蛋白H1.4［21］。有研究证明KDM4A、KDM4B和（或）KDM4C在乳腺、结直肠、口腔［22］、甲状腺［23］、肺及前列腺等肿瘤中均呈现过表达，它们是肿瘤细胞迅速生长所必需的去甲基化酶，这可能是由于其具备调节转录因子表达的作用，如雄激素和雌激素受体。本课题通过沉默KDM4A，探索转录因子Snail1表达的改变，证实了通过干扰组蛋白修饰的变化可以阻滞EMT的发展进程。不仅为临床提供了新的前列腺癌诊断依据，也为该疾病的靶向治疗开辟了新局面。