下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价

余学高 邓间开 陈耀铭 陈培松 何小洪 钟良英 黄彬

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起。全球约有3.6亿HBV感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病［1］。我国属于HBV感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9 300万例［1］。拉米夫定（lamivudine，LAM）是一种有效的抗病毒药物，用于治疗慢性乙型肝炎和晚期肝病患者［2-3］。然而，长期的拉米夫定单药治疗导致了抗拉米夫定乙型肝炎病毒的出现，治疗1年后，16%～55%的患者出现了病毒突破［4-5］。LAM抗性主要与HBV聚合酶基因的酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（tyrosine-methionine-aspartate-aspartate，YMDD）基序204位突变有关。常见突变是甲硫氨酸变为缬氨酸（reverse transcriptase methionine 204 valine，rtM204V）或异亮氨酸（reverse transcriptase methionine 204 isoleucine，rtM204I）［6-7］。病毒学突破与丙氨酸转氨酶升高分别发生在YMDD突变出现后的2～28周和12～31 周［8-10］。因此，早期检测耐 LAM 突变及进行治疗监测，将有助于医生为慢乙肝患者制订个性化治疗方案。本研究中，我们建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法，并对该方法进行性能评价，以期为临床检测乙型肝炎病毒耐药基因提供新手段。

1 材料与方法

1.1 样本

选取2017年1月至12月间在中山大学附属第一医院接受LAM单药治疗至少3个月的乙型肝炎病毒感染患者，用无菌分离胶管采集患者外周血5 mL，3 500 rpm离心5 min，分离的血清样本用于临床常规HBV DNA荧光定量PCR检测，HBV DNA大于100 IU/mL的患者入组，共229例，其中男性182例，女性47例。年龄17～77岁，平均年龄（46.1±13.63）岁。将入组患者血清转移到无菌低吸附Eppendort管内，冻存于-80℃冰箱备用。

1.2 仪器与试剂

ABI 9700 PCR 仪（LOT N8050200）、磁力架（LOT 4314）、One Touch2仪器（LOT 2457881-5247）、ES仪器（LOT 74200）、DA8600下一代测序仪（LOT sn247560288）、ABI 3500 DX基因分析仪（LOT 4406019）、Qubit 3.0荧光定量 仪（LOT 2321609904）等仪器均购自美国Life Technology公司，核酸提取试剂盒（LOT#DA-Z14648）购自中山大学达安基因股份有限公司，SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（LOT B518141-0100）购自上海生物工程有限公司，Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0（LOT 4480441）、Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit（LOT A26434）、Ion PITMHi-QTMSequencing 200 kit（LOT 4488315）、Qubit®dsDNA HS Assay kit（LOT 1788710）试剂均购自美国Life Technology公司。

1.3 方法

1.3.1 下一代测序法检测YMDD突变

1.3.1.1 样本核酸提取 采用核酸提取试剂盒（离心柱法）提取血清标本中的DNA，按照试剂盒说明书进行操作，使用Qubit 3.0荧光定量仪进行核酸定量。提取后的DNA保存于-20℃。

1.3.1.2 病毒DNA扩增及纯化 采用定性PCR方法对HBV P基因区进行扩增并靶向捕获。根据HBV P基因区设计引物（引物序列见表1），PCR扩增条件如下：95℃预变性15 min；然后94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，共 40个循环；最后72℃延伸7 min。采用上海生物工程有限公司的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，用Qubit 3.0荧光定量仪对纯化后的核酸定量。纯化后的DNA置于-20℃保存。

表1 PCR扩增的目的区域引物序列Table 1 Primer sequence of target region for PCR amplification

1.3.1.3 文库构建 严格按照文库构建试剂盒说明书对纯化后的PCR产物进行文库构建：①末端补平：按要求配制末端补平反应液进行反应；②产物纯化：对末端补平后的产物进行磁珠纯化；③连接接头：按要求分别加相应接头；④产物纯化：对连接接头产物进行磁珠纯化；⑤扩增文库：按要求配制反应体系进行文库扩增；⑥产物纯化：对扩增文库产物进行磁珠纯化；⑦文库定量：采用Qubit 3.0荧光定量仪对文库核酸定量。构建好的文库置于-20℃保存。

1.3.1.4 模板制备和模板富集 构建好的DNA文库经过稀释后使用Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit（Life Technologies公司，美国）试剂盒，在One Touch2仪器及ES仪器（Life Technologies公司，美国）上严格按照说明书操作，进行模板的制备和富集。

1.3.1.5 DA8600测序仪测序 使用Ion PITMHi-QTMSequencing 200 kit（Life Technologies 公司，美国）试剂盒，严格按照说明书操作，对上一步实验收集到的混合文库样本进行下一代测序。

1.3.1.6 结果分析 运用生物信息学分析系统，运行 variantCaller插件，在“Allele Call”项目下，显示为“Absent”或“No Call”，则对应的突变点无突变即为YMDD型。在“Allele Call”项目下，显示为“Heterozygous”或“Homozygous”，则对应的突变位点有突变，判定为对应突变类别（YVDD或YIDD），详见表2。

表2 YMDD突变类别Table 2 Mutation category of YMDD

1.3.2 Sanger测序

使用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒（PCR-测序法）（国食药监械（准）字2014第3401444号），严格按照试剂盒说明书检测并分析结果。具体操作流程：①核酸提取：使用核酸提取试剂盒（离心柱法）；②PCR试剂准备：按要求准备PCR扩增体系试剂；③加样；④PCR扩增：按下列条件扩增：50℃2 min，95℃ 15 min预变性，然后 94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸45 s，共40个循环；最后72℃延伸7 min；⑤产物纯化：按要求进行产物纯化；⑥测序PCR：按要求配制测序PCR体系，按下列条件扩增：96℃1 min预变性，然后96℃变性10 s，50℃复性5 s，60℃延伸4 min，共25个循环；最后4℃保温；⑦测序产物纯化：按要求参照BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit用户手册进行纯化；⑧ABI 3500 DX基因分析仪测序：按要求上机测序；⑨结果分析：运行SeqScanner程序，分析结果。

1.4 统计学分析

采用SPSS软件进行方法学比较的数据分析，Kappa（κ）系数检验进行方法学比较的一致性分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立下一代测序法检测YMDD突变的方法

在229份慢乙肝样本中，下一代测序法检测到 44例rtM204V突变，25例rtM204I突变，5例rtM204V/I混合突变。

2.2 下一代测序法检测YMDD突变的方法学评价

下一代测序法和Sanger测序法均在229份慢乙肝样本中检测到74例YMDD突变。其中Sanger测序法检测到47例rtM204V突变、25例rtM204I突变和2例rtM204V/I混合突变。下一代测序法的灵敏度100%，特异度100%，准确度100%。2种测序方法检测到的突变类型完全符合率为95.95%（71/74），部分符合率为4.05%（3/74），未发现完全不一致（0/74，0%）（图 1）。下一代测序法检测到 3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。

图1 下一代测序法与Sanger测序法检测YMDD突变的结果比较Figure 1 The comparison of next generation sequencing method and Sanger sequencing method

2.3 下一代测序法的重复性

根据Sanger测序法的结果，选取5例基因突变阳性的样本（包含YIDD突变2例，YVDD突变3例）、2例基因突变阴性样本，采用下一代测序法对所选样本进行重复检测，每天上机检测一次，连续重复检测10天。经重复性试验检测，下一代测序法的检测结果均一致，重复性符合率为100%。

2.4 下一代测序法与Sanger测序法的方法学比较

下一代测序法与Sanger测序法的方法学比较结果见表3，2种方法检测YMDD突变的一致性好（Kappa=0.97，P＜0.01）。

表3 下一代测序法与Sanger测序法检测YMDD突变的比较Table 3 The comparison of the next generation sequencing and Sanger sequencing for detection of YMDD mutations

2.5 3例检测结果不一致的分析

下一代测序法与Sanger测序法有3例样本的检测结果不一致，Sanger测序法均只检出YVDD突变，而下一代测序法检出YVDD/YIDD混合突变。这3例患者均为高龄，男性，2例肝硬化，1例肝癌，均为长期用药患者，HBV DNA载量在103～105IU/mL（见表 4）。

表4 下一代测序法与Sanger测序法3例检测结果不一致的分析Table 4 Analysis of inconsistent results between next generation sequencing and Sanger sequencing

3 讨论

HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类似物。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷（酸）类似物（nucleoside acid analogues，NA）已成为抗HBV感染的主要方法之一。NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的乙肝患者，是长期治疗的合理选择［11-13］。乙肝患者在长期治疗中常常对药物出现耐受的情况，是因为HBV是高变异的病毒，在患者接受抗病毒药物治疗时，病毒自身受生存压力而导致变异［1］。拉米夫定是第一个被批准用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物，能显著降低HBV DNA水平，并可使患者肝功能恢复正常和肝脏组织学改善。HBV YMDD变异对拉米夫定用药产生影响，基因组变异为 rt180、rt204 和 rt207［14-16］。目前比较明确与耐药相关的变异主要是HBV聚合酶RT区YMDD基因序列的变异（rt204），发生YVDD或者YIDD变异，导致HBV野生株中蛋氨酸被缬氨酸或异亮氨酸替代。当HBV出现耐药株后，大量复制，严重影响治疗的效果［17］。因此需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，有助于临床判断治疗效果和制定个性化抗病毒治疗方案。

目前常用的检测HBV耐药基因的方法主要有PCR产物直接测序法（即Sanger测序法）、克隆测序法、基因芯片法、PCR-荧光探针法和斑点杂交等方法，不同检测技术的特异性及灵敏度有一定的差异，Sanger测序法被认为是检测DNA变异的金标准，但由于灵敏度较低限制了其应用。该方法只在特定突变达20%以上时才能检测出。克隆测序法可大致确定不同毒株序列之间的相对比例，有助于发现混合株，但是操作繁琐且灵敏度有限。此外，基因芯片法、PCR-荧光探针法和斑点杂交法在临床上均有使用，针对每一个位点分别设计探针或引物，灵敏度各不相同，都只能检测已知的耐药突变位点，效率低下［18-19］。

下一代测序技术是能在单次反应中同时检测来自数千或数百万DNA模板上碱基序列的DNA测序技术。该技术具有高数据通量、短序列读长等特征。目前下一代测序平台主要有基于荧光检测的illumina测序平台和基于质子检测的Life半导体测序平台。随着测序成本的下降，下一代测序技术越来越多地用于疾病研究和诊断治疗中［20-21］。

本研究建立了下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法，并对所建方法进行了评价。下一代测序法对229例临床样本的检测结果显示，YMDD基因突变阳性率为32.31%（74/229），比宋世会等［22］和张笠等［23］报道的高，可能是本研究着重选取长期拉米夫定单药治疗患者和地域差异导致。Sanger测序法检测到47例rtM204V突变、25例rtM204I突变和2例rtM204V/I混合突变。下一代测序方法检出44例rtM204V突变，25例rtM204I突变和5例rtM204V/I混合突变。下一代测序法的灵敏度为100%，特异度100%，准确度100%，完全符合率为95.95%（71/74），部分符合率为4.05%（3/74），未发现完全不一致（0/74 0%）。通过重复性实验下一代测序法的重复性符合率100%。2种方法的一致性（κ）为 0.97（P＜0.01）。其中有3例样本在Sanger测序法只检出rtM204V突变，在下一代测序法中检出rtM204V/I混合突变。结果提示下一代测序法的检测灵敏度高于Sanger测序法，能检测到Sanger测序法漏检的混合突变。Sanger测序法只能在突变比例大于20%时检出性能好，结果仅代表优势序列的信息，无法早期发现耐药突变。本研究不足之处在于由于实验条件限制并没有做克隆测序进一步验证3例不一致样本。

本研究成功建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法。该方法灵敏度高，特异性好，重复性好，准确性高，比Sanger测序法更灵敏，能检测到更多的混合突变，为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段，同时为其他病原体耐药基因的检测提供了新思路。随着下一代测序技术发展，操作自动化程度越来越高，测序成本越来越低，能更好地应用于临床检测。