不同HBV基因型慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA、PreS1、HBeAg检测结果分析
2019-11-30吴湃吴坤河刘海燕张斗星胡安群
吴湃 吴坤河 刘海燕 张斗星 胡安群★
乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是一种在我国比较高发的传染病，它是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持续感染引起。根据基因组序列异质性，HBV可分为8种基因型（A型～H型）［1］。各种基因型HBV对于药物的效果及患者的预后有一定的差异［2］。因此，有必要对患者感染的HBV进行基因分型。据报道，各种基因型HBV在全球不同地区的分布呈现不同的流行病学特点［3］。我国感染的HBV主要以B型和C型为主，其中B型以Ba型为主。HBV在我国北方以C型为主，而在南方则为B型较高［4］。
对HBV感染进行监测及病情评估，对于患者的治疗方案选择与疗效非常重要。在临床实践中，HBV DNA、乙型肝炎E抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝病毒前S1蛋白抗原（Pre-S1 antigen，PreS1）是反映HBV感染状态和预后的重要指标［5］。而这3个指标在不同基因型HBV感染患者血液中的表现的研究，在国内外研究尚少，并存在一定的争议。因此，本研究通过检测并比较HBV DNA含量、HBeAg、PreS1抗原在不同基因型HBV感染患者中的差异，为乙型病毒性肝炎的个体化与有效诊疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 患者与标本采集
随机选取2017年1月份至8月份在安徽医科大学附属安庆医院住院的慢性乙肝患者共226例，其中男153例，女73例，年龄17～73岁。所有患者均符合2015年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准［6］；乙型肝炎病毒表面抗原定性实验为阴性结果或乙型肝炎病毒表面抗原定量结果低于0.05 IU/mL的患者均不纳入本研究。本研究严格保密患者的个人信息与隐私，遵守安徽医科大学附属安庆医院对医学伦理方面的相关规定。于患者入院第二天清晨，采集空腹血清用于后续检测。
1.2 材料与方法
1.2.1 试剂
病毒基因组DNA提取试剂盒购自于天根生物（北京）有限公司，巢式PCR选用日本takara生物公司的Pyrobest DNA polymerase试剂盒，50 bp DNA分子量标准（50 bp～400 bp）购自于北京庄盟生物公司，引物由上海生工生物公司合成。HBV DNA荧光定量PCR试剂盒由中山大学达安基因公司生产，HBeAg体外检测试剂盒购自于厦门英科新创科技公司，乙肝病毒前Sl抗原体外检测试剂盒购自于上海阿尔法生物技术公司。
1.2.2 HBV DNA基因分型检测
先按照病毒基因组DNA提取试剂盒说明书操作流程，提取患者血液标本中的乙型肝炎病毒DNA基因组；然后采用巢式PCR技术进行两轮扩增及检测，引物设计如表1。第一轮PCR扩增之引物针对HBV保守序列设计，扩增程序为：94℃预变性 2 min，94℃ 变性 30 s，58℃ 退火 30s，72℃延伸2.5 min，进行30个循环，最后72℃ 延伸10 min。第二轮PCR扩增之引物针对人群中HBV主要类型（B、C亚型）特异基因序列设计，扩增程序为：94℃预变性 2 min，94℃变性 30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析，50 bp DNA分子量标准作为为电泳参照。
1.2.3 HBV DNA定量检测
HBV DNA定量检测采用实时荧光定量PCR法，使用美国ABI 7300型荧光定量PCR仪进行扩增检测。患者血液中HBV DNA含量≥1 000 IU/mL则判断为阳性。
1.2.4 HBeAg检测
HBeAg检测采用一步法双抗体夹心ELISA法，严格按照HBeAg体外检测试剂盒说明书进行操作，并根据说明书给出的公式计算出临界值（Cut-off value）及判读结果。
1.2.5 PreS1抗原检测
Prs1抗原检测采用两步法双抗体夹心ELISA法，严格按照乙肝病毒前Sl抗原体外检测试剂盒说明书进行操作，并根据说明书给出的公式计算出临界值及判断结果。
表1 巢式PCR检测HBV基因型的引物Table 1 Primers for detection of HBV genotypes by nested PCR
1.3 统计分析
本研究的实验数据统计分析运用SPSS 20.0版本软件包。计数资料采用百分比（%）表示，采用χ2检验进行统计学分析，P＜0.05表示差异有显著性意义。
2 结果
2.1 患者感染的HBV基因分型结果
选择两对引物（HBV保守序列引物、B或C亚型特异性引物），运用巢式PCR技术对226例乙型病毒性肝炎患者血清进行基因型检测分析。其中，B基因型引物的阳性扩增片段产物为279 bp，C基因型引物的阳性扩增片段产物为120 bp，与理论上目标基因产物片段大小一致。统计结果显示，B基因型占比为58.0%（131例/总数226例），C基因型占41.1%（93例/226例），其他基因型占0.9%（2例/226例），HBV以B、C基因型为主。
2.2 B、C基因型患者中的HBV DNA表达情况
采用荧光实时定量PCR法对乙肝病毒患者HBV DNA进行检测，结果显示，B基因型患者中HBV DNA阳性率为57.2%（75/131）；C基因型患者中HBV DNA阳性率为63.4%（59/93）。卡方检验结果显示，HBV DNA阳性率在B型患者和C型患者中无显著性差异，见表2。
表2 B、C基因型患者中的HBV DNA表达情况Table 2 Expression of HBV DNA in genotype B，C infected patients
2.3 B、C基因型患者的PreS1抗原表达情况
采用双抗体夹心ELISA法的两步法对乙肝病毒患者PreS1抗原进行检测，结果发现，B基因型患者中PreS1抗原阳性率为48.1%（63/131）；C基因型患者中Pres1抗原阳性率为48.4%（45/93）。卡方检验结果显示，PreS1抗原阳性率在B型患者和C型患者中差异不显著（P＞0.05），见表3。
表3 B、C基因型患者的PreS1抗原表达情况Table 3 Expression of PreS1 in genotype B，C infected patients
2.4 B、C基因型患者中的HBeAg表达情况
采用双抗体夹心ELISA法的两步法对乙肝病毒患者中的HBeAg抗原进行检测，结果发现，B基因型患者中HBeAg阳性率为32.1%（42/131）；C基因型患者中HBeAg阳性率为46.2%。卡方检验结果显示，HBeAg阳性率在B型患者和C型患者中差异显著（P＜0.05），见表4。
表4 B、C基因型患者中的HBeAg表达情况Table 4 Expression of HBeAg in genotype B，C infected patients
3 讨论
控制患者体内HBV病毒复制是乙型病毒性肝炎治疗的一个重要策略。干扰素和核苷酸类抑制物是目前常规的乙肝抗病毒药物，而这两类药物在不同基因型患者中的治疗效果有一定差异［7-9］，这很可能是由于不同基因型患者产生的耐药突变率各异［10-12］。因此，乙肝患者的基因分型对乙肝的诊断和治疗中有重要的指导意义。本研究针对各基因型HBV基因设计特异性引物，并应用巢式PCR技术对安徽安庆地区慢性乙型病毒性肝炎患者进行基因分型检测，经统计分析发现，该地区慢性乙肝患者的HBV感染是以B基因型（占58.0%）与C基因型（占41.1%）为主，其他基因型较少见。该调查结果与同行在我国中部地区的调查报道一致，这为该地区的乙肝疫情的预防政策制定及患者诊疗的药物选择提供了重要的依据［3］。
大量研究已证实，HBV DNA、HBeAg、PreS1抗原是评估患者体内乙肝病毒感染状况、病情进展及治疗效果的重要指标，在临床患者诊疗中应用广泛［5］。本研究检测了不同HBV基因型患者中这3个指标的表达情况。研究结果显示，C基因型HBV感染的患者血液HBeAg阳性率明显高于B基因型患者，而血液中HBV DNA阳性率与PreS1抗原阳性率在B型与C型患者中没有明显差异，本研究结果与秦望森等报道的结果一致［13-14］。
HBV DNA含量检测是反映乙肝病毒在患者体内复制状况的最直接指标。本研究发现在不同HBV基因组HBV DNA阳性率没有显著差别，这与以往同行的实验结果是一致的［15-16］。但据报道，C基因型患者中HBV DNA高拷贝者（≥100 000 IU/mL）比例明显比B基因型要高［17］，这提示C型HBV患者有更高的病毒复制［18］。但国内也有乙肝病毒高拷贝组在B型和C型中没有明显差异的报道［19］，这可能与研究对象选取范围的差异有关。
PreS1抗原在HBV感染的最早期即可出现，因而可以起到早期诊断的作用。它与HBV DNA检出率高度吻合，随HBeAg消失而消失，可作为病毒清除与病毒转阴的指标。PreS1抗原阳性的患者具有更大的病毒传染性，它能反映HBV病毒复制和传染性的指标［19］。本研究结果显示，PreS1抗原在不同HBV基因型中无显著性差别，与HBV DNA检测结果一致。
HBeAg是乙肝病毒核心颗粒中的一种可溶性蛋白质。它的出现往往迟于HBsAg，而消失却早于HBsAg。它在乙肝活动期检出率升高，表明肝细胞有较严重的损伤，患者有很强的传染性。因此，它是一个反映乙肝病情进展及病毒传染性的血清学标志物［21］。本研究发现，C基因型HBV患者比B基因型有更高的HBeAg阳性率，与国内同行的研究报道一致［14］。这提示C基因型HBV患者可能病毒复制活动更活跃，病情更严重，疗效与预后更差。
因此，在安徽安庆地区等我国中部地区慢性乙肝患者的卫生防治政策上，应重点关注HBV主要基因型（B与C型）的防治。HBV DNA含量与PreS1抗原检测，对准确评估病毒复制情况及患者的病情非常有帮助。而C基因型HBV感染患者具有高HBeAg阳性率、高传染性及及严重的病情发展，更应引起高度重视及采取有效的诊治措施。
