慢病毒介导HMGN5基因沉默对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究

孙娟 信艳萍 张国梅 田晓娜 刘会敏

卵巢癌是世界上最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，也是女性死亡最常见的原因，在过去几十年中其发病率不断上升［1］。近年来随着医学技术的发展及医疗设施的改善，卵巢癌的诊断和治疗取得了较大进展，但患者预后仍不理想［2］。由于卵巢癌早期症状不明显，且缺乏有效的诊断方法，大多数卵巢癌患者被诊断时已处中晚期，患者5年生存率＜30%［3］。因此，亟需了解卵巢癌的发病机制，以期建立针对这种致命疾病的新型治疗和诊断策略。高迁移率族核小体结合域5（High-mobility group nucleosome-binding domain 5，HMGN5）是HMGNs家族成员之一，该基因位于人Xq13.3染色体区域［4］。最近的研究表明HMGN5与染色质调节因子结合调节DNA复制、DNA修复、组蛋白修饰和基因转录和表达［5］。目前大量研究证实，HMGN5在多种类型的肿瘤中过度表达，包括乳腺癌、神经胶质瘤和肾癌，发挥致癌作用［6-9］。例如，Liu等报道，敲除HMGN5显著抑制食管鳞状细胞癌细胞生长并诱导细胞凋亡，此外，敲低HMGN5增加了食管鳞状细胞癌细胞对顺铂的敏感性［10］。Gan等研究显示，HMGN5的敲低降低了人尿路上皮膀胱癌5637细胞的活力、集落形成和侵袭，增加了细胞对顺铂的化学敏感性［11］。然而，HMGN5在卵巢癌中的功能和分子机制尚未阐明。因此，本研究探究了HMGN5在卵巢癌细胞中的作用及其相关的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢上皮细胞株IOSE及卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、HO-8910、Caov3（美国 ATCC 细胞库）；MTT试剂（美国Sigma公司）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（杭州四季青生物工程材料有限公司）；HMGN5 shRNA慢病毒载体及阴性对照（上海吉玛制药有限公司）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂（美国Amresco公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；SYBR premix Ex Taq Kit检测试剂盒（日本TaKaRa公司）；Transwell小室（美国Millipore公司）；Matrigel基质胶（美国BD公司）；HMGN5、PCNA、MMP-9抗体（美国Cell Sigaling Technology公司）；Wnt1和β-catenin抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 细胞培养

分别将人卵巢上皮细胞株IOSE及卵巢癌细胞株 SKOV3、A2780、HO-8910、Caov3 培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。在倒置显微镜下观察细胞生长状态，细胞贴壁后，及时更换新鲜培养液，待细胞汇合度达80%以上时，使用胰蛋白酶消化细胞，以1∶3进行传代培养，处于对数期的细胞进行实验。

1.3 SKOV3细胞慢病毒转染

HMGN5 shRNA慢病毒载体及阴性对照慢病毒载体由上海吉玛制药有限公司构建并包装。将对数生长期SKOV3细胞种植于6孔板中，种植密度为1×105/孔，于37℃恒温培养箱继续培养，待细胞生长密度达50%时进行感染，向每孔细胞中加入1∶1比例混合的RPMI-1640培养液和慢病毒溶液2 mL，感染12 h后更换为正常培养液。其中感染HMGN5 shRNA慢病毒载体的SKOV3细胞记为sh-HMGN5组，感染阴性对照慢病毒载体的SKOV3细胞记为NC组，未进行感染处理的SKOV3细胞记为Blank组，各组SKOV3细胞置于37℃培养箱中继续培养。

1.4 RT-qPCR法检测

分别收集对数生长期的卵巢上皮细胞、不同卵巢癌细胞及转染48 h后各组SKOV3细胞，采用Trizol法裂解细胞，分别提取细胞中总RNA，按照逆转录盒使用说明书将RNA合成cDNA，并调整cDNA浓度，使用SYBR premix Ex Taq Kit检测试剂盒进行RT-qPCR检测。内参基因为GAPDH，RT-qPCR反应程序设置为：94℃预变性5 min，94℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共设40个循环。反应结束后分析熔链曲线以确定产物特异性，采用相对定量2-△△CT计算各细胞中HMGN5 mRNA 相对表达量，其中-△△CT=目的基因 Ct值-内参基因Ct值。实验重复3次，取均值。

1.5 Western blot检测

收集转染48 h后各组SKOV3细胞，向细胞中加入RIPA细胞裂解液，裂解30 min提取细胞中总蛋白。以BCA法检测提取蛋白的浓度。取40 μg蛋白样品进行上样，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压设置为80 V，分离胶电压设置为120 V，待蛋白分离后电转至硝酸纤维素膜上。将膜置于封闭液中室温孵育2 h。分别加入相应稀释的一抗，（HMGN5一抗1∶800稀释、PCNA一抗1∶500稀释、MMP-9一抗1∶500稀释、Wnt1一抗1∶500稀释、β-catenin一抗1∶500稀释），4℃下过夜孵育，TBST洗膜，加入1∶3 000稀释的二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜，以ECL化学发光，使用凝胶成像仪拍照。以GAPDH为内参，采用Image J图像分析软件对各条带灰度值进行分析。分别计算目的蛋白相对表达水平，实验重复3次，取均值。

1.6 MTT法检测

对数生长期的SKOV3细胞以1×103/孔接种到96孔板中，待细胞生长汇合度达50%时按照上述1.3方法进行感染和分组，分别在感染24、48、72 h时，向每孔细胞中加入MTT溶液100 μL，37℃继续培养4 h，弃上清液，向细胞中加入150 μL二甲基亚砜，振荡反应10 min，待沉淀完全溶解后，在酶标仪450 nm波长处测定各孔细胞吸光度值（A值）。每组SKOV3细胞每个时间点设置4个复孔，实验重复3次，取均值。

1.7 细胞划痕实验

感染后各组SKOV3细胞以3×104/孔接种到6孔板中，放置在37℃培养箱继续培养，待细胞生长汇合达90%以上时，将培养液更换成低浓度（0.5%）胎牛血清的培养液，使用划痕仪对细胞进行划痕，以PBS洗涤划掉的细胞，加入0.5%胎牛血清的培养液，放置在37℃培养箱继续培养24 h，分别在划痕0和24 h观察细胞划痕宽度，计算细胞迁移率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度。实验重复3次，取均值。

1.8 Transwell实验

Matrigel基质胶以无血清培养基继续稀释，将稀释的Matrigel胶加入到Transwell小室的上室，室温包被待用。待测各组SKOV3细胞以胰蛋白酶消化，以无血清培养液重悬细胞，制成1×105/mL的细胞悬液。取200 μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液。将Transwell小室放置在37℃恒温培养箱中培养48 h。用棉签拭去上室未穿膜的细胞，PBS洗涤1次，以4%甲醛固定10 min，以0.1%结晶紫染色30 min，以PBS洗涤后风干，在倒置显微镜下随机选取5个视野观察并计数穿膜细胞数。实验重复3次，取均值。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，两组间差异比较采用SNK-q检验分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGN5在卵巢癌细胞中呈高表达

采用RT-qPCR检测卵巢上皮细胞株IOSE和4株不同卵巢癌细胞中HMGN5的表达情况，结果如图1所示，与IOSE细胞相比，卵巢癌SKOV3、A2780、HO-8910、Caov3细胞中 HMGN5的表达量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。HMGN5在卵巢癌SKOV3细胞中的表达量最高，因此以SKOV3细胞为研究对象进行后续实验。

2.2 转染HMGN5 shRNA慢病毒载体可沉默SKOV3细胞中HMGN5基因

采用慢病毒转染SKOV3细胞后，RT-qPCR和Western blot检测结果如图2所示，与Blank组和NC组相比，sh-HMGN5组SKOV3细胞中HMGN5 mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与Blank组相比，NC 组SKOV3细胞中HMGN5 mRNA和蛋白表达水平无明显改变，差异具有统计学意义（P＞0.05）。提示沉默HMGN5基因的SKOV3细胞株构建成功。

图1 RT-qPCR检测5种细胞中HMGN5的表达量Figure 1 RT-qPCR detection of HMGN5 expression in five cells

图2 各组SKOV3细胞中HMGN5 mRNA和蛋白表达水平比较Figure 2 Comparison of HMGN5 mRNA and protein expression levels in SKOV3 cells

2.3 沉默HMGN5基因抑制SKOV3细胞增殖能力

图3 MTT检测各组SKOV3细胞在不同时间A值Figure 3 MTT detection of SKOV3 cells in each group at different time A value

MTT检测结果如图3所示，与Blank组和NC组相比，sh-HMGN5组SKOV3细胞在24、48、72 h时A值明显下降（F值分别为27.409、38.966、36.182，P＜0.05），差异有统计学意义；与 Blank组相比，NC组SKOV3细胞在24、48、72 h时A值无明显改变（P＞0.05），差异无统计学意义。提示沉默HMGN5基因能够抑制SKOV3细胞增殖。

2.4 沉默HMGN5基因抑制SKOV3细胞迁移和侵袭

划痕实验结果显示（见图4A和4C），与Blank组和NC组相比，sh-HMGN5组SKOV3细胞迁移率明显降低（P＜0.05），与 Blank组相比，NC 组SKOV3细胞迁移率无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。Transwell实验检测结果显示（见图4B和4C），与Blank组和NC组相比，sh-HMGN5组侵袭细胞数明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），与Blank组相比，NC组侵袭细胞数无明显改变（P＞0.05）。提示沉默HMGN5基因能够阻碍SKOV3细胞迁移和侵袭能力。

图4 划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力Figure 4 Scratch test and Transwell test to detect cell migration and invasion

2.5 沉默HMGN5基因对SKOV3细胞中蛋白表达的影响

Western blot检测结果如图5所示，与Blank组和NC组相比，sh-HMGN5组SKOV3细胞中PCNA、MMP-9、Wnt1和β-catenin蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），与Blank组相比，NC组SKOV3细胞中 PCNA、MMP-9、Wnt1和 β-catenin蛋白表达水平无明显改变（P＞0.05）。提示沉默HMGN5基因能够抑制SKOV3细胞中PCNA和MMP-2蛋白表达及Wnt/β-catenin信号通路的激活。

图5 Western blot检测各组SKOV3细胞中各蛋白表达情况Figure 5 Western blot analysis of protein expression in SKOV3 cells

3 讨论

有研究表明，HMGN5在卵巢癌组织中呈高表达，且HMGN5的表达量与卵巢癌的TNM临床分期、肿瘤大小及患者生存时间密切相关［12］。在本研究中，通过RT-qPCR检测发现4株不同卵巢癌细胞中HMGN5的表达显著高于正常卵巢上皮细胞。这些数据表明HMGN5过表达可能与卵巢癌的进展相关。在过去的几年中，HMGN5的异位高表达水平已在几种恶性肿瘤中得到证实，包括前列腺癌、肺癌、骨肉瘤和胶质瘤，HMGN5能够促进某些类型癌症的肿瘤进展，表明该蛋白在癌症治疗中的潜在作用［13-15］。Wu等研究显示，HMGN5在膀胱癌组织中过表达，并且HMGN5蛋白表达水平对膀胱癌临床病理分期和预后有重要影响［16］。Xin报道指出，HMGN5的表达恢复部分消除了miR-488介导的肾细胞癌细胞生长和转移抑制［17］。然而，目前尚未说明HMGN5在卵巢癌中的作用。为阐明HMGN5在卵巢癌中的作用，本实验采用功能丧失的方法即在卵巢癌SKOV3细胞中转染HMGN5 siRNA慢病毒载体敲低内源性HMGN5表达，探究HMGN5对SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能涉及的机制。

本实验筛选HMGN5基础表达最高的卵巢癌细胞株SKOV3，并通过慢病毒转染法将HMGN5 siRNA慢病毒载体转染至SKOV3细胞，通过RT-qPCR和Western blot验证成功构建了HMGN5沉默的SKOV3细胞株。MTT法检测结果显示，沉默HMGN5基因能够显著抑制SKOV3细胞增殖。划痕实验证实沉默HMGN5基因可阻碍SKOV3细胞体外迁移能力。Transwell实验表明沉默HMGN5基因能够抑制SKOV3细胞侵袭能力。所有这些数据与先前研究的HMGN5促进肿瘤进展的数据相一致。PCNA与细胞中DNA合成密切相关，在启动细胞增殖过程中发挥重要作用，目前已将其作为细胞处于增殖状态的良好指标［18］。MMP-9属于MMP家族成员，在降解细胞外基质中扮演重要角色，目前研究证实MMP-9通过促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力促使肿瘤发生转移［19］。本实验Western blot结果表明，沉默HMGN5基因明显抑制SKOV3细胞中PCNA和MMP-9蛋白表达。这与已有关于敲低HMGN5减少细胞中MMP-9表达的研究相符。

Zhao等［20］强调，与正常胰管上皮细胞和邻近的正常胰腺组织相比，HMGN5的表达在胰腺导管腺癌细胞系和组织中显著上调，HMGN5通过激活胰腺导管腺癌中Wnt/β-catenin信号通路促进增殖和侵袭。Wnt1是一种激活Wnt信号通路的分泌配体，其与肿瘤发生和进展密切相关［21］。β-catenin是从细胞质到细胞核的Wnt信号的关键转导物［22］。近期研究显示，Wnt/β-catenin 信号通路在卵巢癌中异常激活，在卵巢癌的发生和发展中发挥重要作用［23-25］。类似于Zhao等人的研究结果，在本研究中观察到在卵巢癌SKOV3细胞中HMGN5沉默后，Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt1和β-catenin的表达明显下调。本实验表明HMGN5可能正向调节Wnt/β-catenin信号转导通路的激活。提示HMGN5沉默对SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制可能的机制是通过阻碍Wnt/β-catenin信号转导通路的活化实现的。所有这些数据显示HMGN5可能通过激活Wnt/βcatenin信号传导途径促进肿瘤进展。

总之，本研究首次证明HMGN5在卵巢癌细胞系中表达上调，此外，沉默HMGN5可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活抑制SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭。本实验为卵巢癌的进展的机制提供了新的见解，并表明HMGN5可能是卵巢癌诊断和治疗的潜在靶点。