OSU-03012对人结肠癌LoVo细胞增殖侵袭及COX-2、VEGF、MMP-2表达的影响

王 虹

（郑州市第七人民医院，河南郑州 450000）

结肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一[1]。磷酸肌醇3激酶/磷脂酰肌醇依赖性激酶1/蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase/phosphoinositide-dependent kinase 1/protein kinase B，PI3K/PDK1/AKT）信号通路与结肠癌的发生、发展密切相关[2]。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素E2合成的限速酶，通过介导PI3K/PDK1/AKT信号通路参与多种恶性肿瘤的发生，被视作潜在的恶性肿瘤治疗靶点[3]。化合物OSU-03012为COX-2抑制剂的衍生物，有研究发现其可有效抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭，并促进结肠癌细胞凋亡[4]，但该研究并未观察OSU-03012对COX-2的作用。为此，本研究探讨了OSU-03012对人结肠癌LoVo细胞增殖、侵袭及COX-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表达的影响，以期为寻找结肠癌新的治疗途径提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人结肠癌细胞株LoVo，购自中国科学院上海细胞库；MTT试剂盒，购自上海威奥生物科技有限公司；Transwell小室和Matrigel胶，购自Corning公司（美国）；Trizol试剂，购自天根生化有限公司；反转录试剂盒，购自Takara公司（日本）；COX-2、VEGF、MMP-2、β-actin一抗，购自优宁维生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒及二抗购自碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和分组：LoVo细胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液，在37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到80%时，分别使用0μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的OSU-03012处理细胞作为不同分组。

1.2.2 MTT法检测LoVo细胞的增殖情况：将LoVo细胞接种至96孔板，调整细胞浓度为1×104个/孔。使用不同浓度的OSU-03012分别处理细胞24h、48h、72h。根据MTT试剂盒说明书操作步骤处理细胞，最后使用酶标仪在波长570nm处检测吸光度值。每组设3个复孔。

1.2.3 Transwell法检测LoVo细胞的侵袭能力：取生长状态良好的LoVo细胞，采用不含血清的DMEM/F-12培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养12h，使细胞处于饥饿状态，然后收集细胞调整浓度至2×105个/ml。Transwell上室中加入150μl细胞悬液，下室中加入600μl含不同浓度OSU-03012的培养液（含10%胎牛血清），每组设置3个复孔。在37℃、5% CO2培养箱中继续培养24h后，弃去培养液，用棉签将小室内残留细胞擦去。甲醇固定10min后，结晶紫染色20min。在显微镜下观察穿过基底膜的细胞，拍照并随机选取6个视野统计细胞数量。

1.2.4 qRT-PCR法检测LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的表达情况：各组细胞加入不同浓度OSU-03012后，在37℃、5% CO2培养箱中采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液继续培养24h。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书操作将RNA逆转录为cDNA，根据SYBR GREEN 定量PCR说明书步骤进行qPCR扩增。扩增条件：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃保存10min。以β-actin为内参，COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各检测基因引物序列及产物大小见表1：

表1 各基因引物序列和产物大小

1.2.5 Western Blot法检测LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白的表达情况：各组细胞加入不同浓度OSU-03012后，在37℃、5% CO2培养箱中采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液继续培养24h。然后弃去培养液，胰酶消化处理后，将细胞转移至1.5ml离心管，加入500μl细胞裂解液，充分吹打细胞，然后冰上静置30min，12000rpm离心10min取上清，提取细胞总蛋白并使用BCA试剂盒进行定量。取蛋白提取液（含蛋白40μg）上样进行SDS-PAGE凝胶电泳(5%浓缩胶，12%分离胶)，电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶常温下封闭2h，加入一抗（COX、VEGF一抗稀释比例为1：500，MMP-2一抗稀释比例为1：800，β-actin一抗稀释比例为1：1000）4℃孵育过夜，加入二抗常温孵育1h，显影液显影后曝光并拍照，采用凝胶成像仪扫描显影后的蛋白条带，以β-actin为内参，以目的条带与内参条带灰度值的比值作为各目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计分析 计量数据用平均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验；组内不同时间点比较采用重复测量数据的方差分析。使用GraphPad Prism 6.0进行图片制作与统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSU-03012对结肠癌LoVo细胞细胞增殖能力的影响 OSU-03012作用结肠癌LoVo细胞24h、48h和72h，随着药物浓度的增加LoVo细胞的增殖能力逐渐降低，相同时间点不同浓度间两两比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2：

表2 不同浓度OSU-03012作用不同时间结肠癌LoVo细胞的增殖能力（±s ，n=3）

表2 不同浓度OSU-03012作用不同时间结肠癌LoVo细胞的增殖能力（±s ，n=3）

与0μmol/L组比较：1)P＜0.05；与3μmol/L组比较：2)P＜0.05；与5μmol/L组比较：3)P＜0.05

组别 24h 48h 72h 0μmol/L组 0.526±0.035 0.714±0.026 0.961±0.047 3μmol/L组 0.505±0.032 0.642±0.0311) 0.848±0.0431)5μmol/L组 0.389±0.0181)2) 0.485±0.0271)2) 0.573±0.0391)2)10μmol/L组 0.314±0.0131)2)3) 0.394±0.0101)2)3) 0.468±0.0351)2)3)

2.2 OSU-03012对结肠癌LoVo细胞侵袭能力的影响0μmol/L组、3μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组LoVo细胞穿过基底膜的细胞数分别为（326±23）个、（304±18）个、（221±15）个和（142±13）个，穿过基底膜的细胞数量组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1：

图1 Transwell法结果（×200）

2.3 OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表达的影响 不同浓度OSU-03012作用LoVo细胞24h，LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA的表达水平逐渐降低，不同浓度间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3：

表3 OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表达的影响（±s ，n=3）

表3 OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2 mRNA表达的影响（±s ，n=3）

与0μmol/L组比较：1)P＜0.05；与3μmol/L组比较：2)P＜0.05；与5μmol/L组比较：3)P＜0.05

组别 COX-2 VEGF MMP-2 0μmol/L组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 3μmol/L组 0.81±0.061) 0.84±0.061) 0.88±0.071)5μmol/L组 0.68±0.051)2) 0.72±0.041)2) 0.74±0.041)2)10μmol/L组 0.52±0.021)2)3) 0.58±0.041)2)3) 0.62±0.051)2)3)F 29.215 22.412 16.933 P 0.001 0.002 0.003

2.4 OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白表达的影响 不同浓度OSU-03012作用LoVo细胞24h，LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白的表达水平逐渐降低，不同浓度间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2：

图2 OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2蛋白表达的影响

3 讨论

PI3K/PDK1/AKT信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关，PDK1是该通路的关键蛋白，抑制PDK1激活可能会阻断信号通路的转导，起到抗肿瘤效应[5]。OSU-03012是PDK1抑制剂，体外研究发现可通过阻断PI3K/PDK1/AKT信号通路抑制多种恶性肿瘤细胞系的增殖，并促进细胞凋亡[6]，但其对结肠癌细胞系有无影响尚不明确。

本研究分别采用MTT法、Transwell法检测了OSU-03012对人结肠癌LoVo细胞增殖、侵袭的影响，发现OSU-03012干预可明显抑制LoVo细胞的增殖和侵袭能力，且OSU-03012浓度越高对LoVo细胞增殖和侵袭能力的抑制作用越明显。为进一步探讨OSU-03012发挥作用的可能分子机制，本研究观察了OSU-03012对LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2表达的影响，结果发现，无论是在基因水平还是蛋白水平，OSU-03012干预下LoVo细胞COX-2、VEGF、MMP-2的表达均明显降低，且随着OSU-03012浓度的升高，三者的表达水平逐渐降低。COX-2是前列腺素E2合成的限速酶，在正常结肠上皮细胞中表达水平低，但在结肠癌组织中异常高表达，参与结肠癌的侵袭、转移过程，而COX-2抑制剂能抑制结肠癌细胞的侵袭、转移[7]；VEGF在血管内皮细胞中广泛表达，可诱导血管生成和内皮细胞增殖、迁移，与肿瘤细胞的生长、浸润等过程相关；MMP-2是基质金属蛋白酶家族的重要成员，可通过降解细胞外基质为肿瘤的局部侵袭提供有利条件[8]。由此可见，COX-2、VEGF和MMP-2均与癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为有关。而本研究结果提示，OSU-03012可抑制结肠癌LoVo细胞增殖、侵袭的能力，其发挥作用的分子机制可能与下调COX-2、VEGF和MMP-2的表达有关。