基于高分辨质谱技术的婴幼儿食品中过敏原蛋白质的高灵敏检测

顾艳

（南京市食品药品监督检验院 江苏南京210000）

1 前言

食品检测行业中对食品过敏原检测的方法有3种，分别是液相色谱-串联质谱检测法、聚合酶链式反应法和酶联免疫吸附法。酶联免疫吸附法具有敏感性强、特异性高和实用性强的优点，检测通量较低，在检测时很容易受到其他因素的影响，如抗原-抗体反应不完全、抗体种类限制等，导致检测灵敏度大大降低[1]；聚合酶链式反应法可实现多种目标物同时检测，同样也会受到各种因素的影响，无法检测复杂食品基质中的过敏原；液相色谱-串联质谱检测法具有高通量、高准确度和高灵敏度的特点，目前被广泛应用在食物过敏原蛋白质检测中[2]。目前，在婴幼儿食品过敏原蛋白质检测技术中，仍缺乏高准确度和高灵敏度的检测技术。本文使用高效液相色谱-质谱联用技术和平行反应监测技术，对婴幼儿食品中过敏原成分进行检测分析。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 仪器与设备

超声破碎仪、真空浓缩仪、LC-3000 高效液相质谱仪、3000 Purifier 色谱系统，所使用到的仪器都定期进行校准，检测结果参考性价值高。

2.1.2 材料与试剂

为了确保检测结果的可靠性和真实性，本次实验选择灵敏度高、稳定性好的过敏原蛋白质特征肽段。坚果类选择VGFNTNSLK 和QGQVLTIPQNFAVAK；鸡蛋类选择YPILPEYLQCVK；黄豆类选择SQSDN FEYVSFK；鱼类选择SGFILEEDELK；花生类选择GTGN-LELVAVR；牛奶类选择FALPQYLK。

牛胰蛋白酶、FA、IAA、DTT、EDTA、Tris、Triton X-100、尿素、甲醇、ACN、BCA 试剂盒、C18 硅胶填料、超滤离心管；实验用水经过纯化处理。

2.2 方法

2.2.1 样品提取

使用i-FASP 方法、原位过滤辅助样品预处理、膜上原位样品预处理方法等方法提取样品1[3]。取样品粉末0.1 g，加入1.5 mL C12Im-CI 离子液体，然后利用超声破碎仪提取液，取上清液，并检测其中蛋白质的浓度，检测方法使用BCA 检测，最后对上清液进行保存备用，保存温度在-80℃。

使用丙酮沉淀法提取样品2[4]。取样品粉末0.1 g，加入1.5 mL 提取液，振荡混匀，对样品进行超声和离心，然后同样取上清液，并计算出上清液的体积，接着加入冰丙酮溶液，使冰丙酮含量是上清液体积的4 倍，再进行静置，静置时间2 h，静置温度-20℃，再对其进行离心，最后取出沉淀物，沉淀物需要使用冰丙酮洗涤两次，待晾干后使用碳酸氢铵溶液进行溶解，并使用BCA 检测方法检测蛋白质浓度，最后对样品进行保存备用，保存条件为-80℃。

2.2.2 蛋白质酶解

（1）样品加入到润湿后的超滤离心管内，对其进行离心处理；（2）在膜上加入200 μL DTT 溶液，进行变性处理，变性时间为5 min，温度为95℃，进行离心处理；（3）加入200 μL 的碳酸氢铵溶液（规格为10 mmol/L）进行洗涤，然后进行离心处理；（4）向膜上加20 μg 蛋白酶、45 μL 的碳酸氢铵溶液（规格为10 mmol/L）和5 μL 100 mmol/L IAA 溶液，将样品放置在温度为37℃地方进行自然反应，时间为12 h，随后进行离心处理，然后取出50 μL 的清液；（5）向膜中加入50 μL 水冲洗（水必须要进行去离子处理），进行离心处理，取出50 μL 的清液；（6）使用液相色谱－质谱联用法技术分析所得酶解液[5]。以上步骤中的离心处理都是14 000 r/min 离心20 min。

3 结果

3.1 检测方法的准确性、灵敏度和现象关系确认

为了进一步确认检测方法的准确性、灵敏度和各个肽段的线性范围的准确度，通过制作标准的曲线进行确认[6]。线性方程以Y=AX+B表示，通过线性方程确认线性关系，经过3 次以上的分析发现相差较小，说明检测结果准确性越高，6 种过敏原蛋白质的现象范围详见表1。定量限值以测量浓度范围的最小值为准。

表1 6 种过敏原蛋白质所对应特征肽段的线性范围与定量限

由表1 线性范围最小值可知，此方法具有较高的灵敏度、精密度和准确性。

3.2 实际样品过敏原蛋白检测

为了进一步确认本次研究方法的适用性和可靠性，选择生活中常见的婴儿面包和饼干各2 种进行确认，过敏原检测结果详见表2。

表2 PRM 法检测实际婴幼儿食品中6 种过敏原蛋白质的含量

由表2 可知，检测结果与实际商品成分标识基本相符，说明本次检测方法具有一定的实用性和可靠性。

4 结语

基于高效液相色谱-串联质谱技术，使用平行反应监测技术，能够有效检测出婴儿食品中过敏原蛋白质。相对于其他过敏原检测法，该检测方法具有较高的灵敏度、精密度和准确性，为婴幼儿食品安全提供了保障，同时也在一定程度上弥补了我国食品过敏原检测方法的不足，为食品过敏原标签管理提供了技术支持。另外，必须要选择适当的样品提取方法，筛选优化平行反应监测条件，从而满足高通量、高准确度的检测需求。