菌落总数测量不确定度评定及对生产过程的指导

徐腾月

（中国人民解放军食品检测试验中心 北京 101301）

1 前言

菌落总数可反映被检样品在生产、加工及销售过程中是否符合卫生要求，可为被检样品的卫生学评价提供依据[1]，是压缩干粮评价的重要微生物指标。本文依据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[2]和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[3]对菌落总数进行了不确定度评定。在实际检测过程中，检测结果部分合格，有些在限量标准附近，这时仅依靠检验结果就直接进行判定是不合理的[4]。测量不确定度是对测量结果质量的定量表征，很大程度上决定了测量结果的可用性。在ISO/IEC17025《校准和检测实验室能力的通用要求》[5]中明确指出，检测实验室在必要时需对测量不确定度予以说明，如测定结果在限量值附近时，就要对测量结果进行不确定度的评定[6，7]。国内外研究表明，相关学者大多只是进行不确定度的评定研究，对于测量不确定度在生产过程的指导意义研究较少[8]。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

样品：同一批次压缩干粮（食品车间）；培养基和试剂：平板计数琼脂（PCA）（北京陆桥技术有限责任公司）、氯化钠（北京化工厂）。

2.2 仪器与设备

LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BSC-1500ⅡA2-X 生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；400VW 均质器（interscience）；LRH-250 生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；菌落计数器；DK-98-Ⅱ-A 水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2.3 方法

2.3.1 压缩干粮中菌落总数的测定

依据GB 4789.2—2016 进行检验。操作步骤如下：称取样品；10 倍系列稀释；选取3 个适宜稀释倍数的稀释液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内，同时做空白对照；加入适量的15～20 mL 平板计数琼脂，混匀；放置于（36±1）℃培养箱中培养（48±2）h；培养完成后取出，用肉眼观察，记录同一稀释度中各个培养皿的菌落数量；进行菌落总数的报告[9]。

2.3.2 不确定度来源

微生物测试的主要影响因素包括：取样、样品量、样品种类、目标微生物在样品中的分布、样品中含有微生物数量、样品的稳定性、稀释倍数、读数、重复测试等。本文样品是单一样品，且由同一人员操作完成，故不确定度来源主要是样品的称量过程、稀释过程及菌落计数过程。在微生物检测过程中，B 类不确定度贡献较小，而重复测量带来的不确定度占主要部分，故采用A 类不确定度进行评定。

2.3.3 不确定度分析

建立数学模型：

其中，X—菌落总数；Y—实验结果。

3 结果与分析

本次实验由同一人员在一定时间内对同一批次的样品做了15 次平行测定，得到的菌落总数测定结果详见表1。本次实验空白对照无菌落生长。

表1 压缩干粮菌落总数15 次重复测量结果

具体计算过程如下：

（1）列出测量结果xi。

（2）取对数lgxi，得到对数lgxi的平均值为：

（3）求残差lgxi－lg。

（4）求残差的平方（lgxi－lg）2，得到残差平方和为

（5）合成标准不确定度：

测量结果为15 次重复测量的平均值，故平均值的标准不确定度为

（6）扩展不确定度：

由于置信概率p＝95%，自由度ν＝15－1＝14，由t分布表可得k＝2.145。

于是U95＝k×u（lg）＝2.145×0.062 89＝0.134 9。

（7）取反对数，由lgx坐标回到x坐标：

由于lg 与x之间的非线性关系，不能直接求扩展不确定度U的反对数。因此，首先确定lgx的取值范围为：lgx＝3.481 9±0.134 9，或写成

取反对数后可得2 200≤x≤4 100。

4 结论

（1）本次实验的样品是均一的、稳定的；（2）若本次实验的空白对照有菌落生长，说明实验室洁净度不符合要求，实验结果无效，需重新进行检测；（3）该批压缩干粮菌落总数测量不确定度为2200～4100CFU/g，p=95%。GB/T 20980—2007《压缩饼干》[10]中规定的压缩干粮菌落总数限量标准为≤2000 CFU/g，依据《声明检测或校准结果及与规范符合性的指南》，该批压缩干粮不符合规范要求；（4）若在本批产品中只进行常规检测，而不进行测量不确定度的评定，会得到不同的结果。例如，x4（1 300 CFU/g）检测结果表明产品是合格的，x15（2 000 CFU/g）检测结果等于限量值，而x5（9 400 CFU/g）是不合格的。

5 指导意义

通过15 次重复检测可以看出，同一批次压缩干粮菌落总数检测结果并不稳定，表明生产过程的稳定性较差。食品生产企业可以对造成生产过程不稳定的原因进行分析。另外，通过菌落总数测量不确定度的评定显示产品的菌落总数不符合产品规范要求，菌落总数超标。菌落总数超标主要是生产工艺中的卫生问题和包装过程中的污染问题造成的。食品生产企业可以根据生产工艺的关键控制点进行监控，查找产品生产期间未严格按照工厂卫生标准操作程序（SSOP）的操作，对不规范的操作进行纠正指导，再对生产出的产品进行检测，观察问题是否得到解决。造成菌落总数不稳定的主要原因是设备设施不稳定，应对导致菌落总数升高的设备进行排查，找出影响设备，定期对设备设施进行维护保养清洁消毒，保证其完好性和稳定性。

生产企业应通过理解并运用不确定度，规范食品生产过程，找出影响产品卫生的关键环节，通过对生产过程进行控制，提高产品质量。

6 结语

菌落总数测量不确定度评定可使检测结果更加接近真实值，可用于评价实验室的测量能力，且提高了人们利用检测结果判定产品合格与否的准确率，可为食品生产企业发现其食品生产问题提供参考。