唾液酸对急性酒精性肝损伤小鼠的抗氧化作用

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(1.北京大学公共卫生学院,北京 100191;2.食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室,北京 100191;3.中科鸿基生物科技有限公司,山西晋中 031100)

唾液酸又称燕窝酸,现代研究证明唾液酸含量可占燕窝干重的7%～15%左右[1],是燕窝的重要特征成分[2],最初从牛颌下腺黏蛋白中分离而出,由此得名。唾液酸是一类九碳单糖的衍生物,也是所有神经氨酸或酮基-脱氧壬酮糖酸(KDN)的N-或O-衍生物总称[3],位于细胞膜糖蛋白侧链末端,是细胞膜表面受体的重要组成部分[4]。目前已经有很多唾液酸生物学功能的研究,其中以N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac,NANA)的研究居多。

唾液酸具有多种的生理功能,如外源性唾液酸的添加可以改善子代学习记忆[5-6]、减轻动脉粥样硬化[7]、预防高脂饮食诱导的高脂血症[8]等;内源性唾液酸可以用来预测和评估人类疾病潜在风险[9-11]等,此外有研究发现唾液酸可能具有抗氧化功能。何培元等[12]通过手术摘除大鼠卵巢诱导肝脏氧化应激,利用燕窝调节肝细胞抗氧化通路中相关基因SOD 1/2/3及PARP 1的mRNA表达,发挥抗氧化作用,进而保护肝细胞,基于唾液酸在燕窝中重要功能特性原因,推测燕窝调节抗氧化功能可能与其中的唾液酸有关。此外研究表明NANA可作为抗氧化剂与H2O2反应,产生H2O与无毒羧酸,且不会产生氧自由基[13]。该反应在体内任何pH环境下都有可能发生,在pH大于5时,H2O2的浓度下降速度更快[14]。同时在肥胖相关疾病的研究中发现,NANA可以预防高脂膳食诱导的炎症和氧化应激反应[7-8]。目前关于对唾液酸改善乙醇所致的氧化损伤尚未见报道,无对于唾液酸抗氧化能力的剂量反应关系的相关研究。

为进一步探索唾液酸对乙醇所致氧化损伤的改善作用以及其最佳作用剂量,本研究以ICR小鼠建立急性酒精肝损伤的动物模型,探索唾液酸对小鼠氧化应激的保护作用,并初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

唾液酸(纯度≥98.0%,CAS:131-48-6) 中科鸿基生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)测试盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)测试盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)测试盒、蛋白质羰基(Protein Carbonyl,PC)试剂盒、蛋白定量试剂盒 南京建成生物工程研究所;SPF级ICR雄性小鼠(50只,体重(25.0±5.0) g,实验动物合格证号:SCXX(京)2016-0010,6～7周龄)、饲料 北京大学医学部实验动物科学部。

SPN3001F电子分析天平 奥豪斯;FLUO star Omega多功能酶标仪 美国BMG LABTECH公司;BFX5-320型低温自动平衡离心机 北京白洋离心机厂;Allegra X-30R Centrifuge台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN COULTER公司;HH·S11-1电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 小鼠给予维持饲料,光/暗周期12 h/12 h(光照时间07:00～19:00),室内温度为(23±2) ℃,湿度为50%～60%,50只雄性ICR小鼠经适应性饲养1周后,称重,按体重随机分为5组,分别为空白对照组、模型组、唾液酸低、中、高剂量组(低剂量组:15 mg/kg·bw;中剂量组:30 mg/kg·bw;高剂量组:60 mg/kg·bw),每组各10只。各组均给予维持饲料,自由进食、饮用无菌去离子水。

1.2.2 造模及给药方法 实验期间每天上午8:00～10:00对各剂量组进行灌胃,给予不同剂量的受试样品,对照组和模型组经口灌胃双蒸水,灌胃容量为0.1 mL/10 g,并根据体重来调整灌胃剂量,灌胃期间自由取食和饮水。连续30 d灌胃并每隔5 d记录体重和摄食量。末次灌胃后,模型组和3个剂量组禁食16 h(过夜),然后一次性灌胃给予50%乙醇12 mL/kg·bw,6 h后取材(空白对照组不作处理)。每5 d在同一时间上午10:00记录体重与食物消耗量,并计算食物利用率。

食物利用率(%)=体重增加量×100/鼠粮消耗量

1.2.3 测试样品的制备和检测 实验小鼠灌胃乙醇6 h后,摘眼球取血,3000 r/min离心10 min(用于测血清SOD、GSH-Px、GSH和MDA)。

断颈处死后取肝组织在预冷的0.9%生理盐水中漂洗,洗净组织表面血迹,并用滤纸吸干水分。称重后放入10 mL离心管中,加入体积是肝组织重量9倍的冷0.9%生理盐水,用眼科小剪刀迅速剪碎组织,冰水浴组织捣碎机制备组织匀浆液,4 ℃下3000 r/min离心10 min,取上清进行测定。

1.2.4 指标测定 SOD和GSH-Px活性,GSH、MDA、蛋白质羰基和总蛋白含量指标检测参照对应试剂盒说明书进行测定。

1.3 数据处理

实验结果表示为平均值±标准差(Mean±SD)。所有数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异,以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。方差齐时,采用LSD法进行两两比较;方差不齐时,采用Tamhane’s法进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化

由图1、表1可知,适应性喂养后各组动物的初始体重无明显差异,体重随实验时间的延长而增加,同时各组小鼠的食物利用率无显著性差异(P>0.05)。实验中小鼠体重由30 g左右增长至35 g左右,小鼠体重增长缓慢,增重率逐渐下降,在饲料消耗量一直保持稳定的趋势下,食物利用率处于降低趋势。实验过程中小鼠无异常表现,表明唾液酸在实验剂量范围内对小鼠无毒性作用,对其正常生长发育无影响。

图1 唾液酸对小鼠体重的影响Fig.1 Effects of sialic acid on the weight of mice

表1 唾液酸对小鼠食物利用率的影响Table 1 Effects of sialic acid on food utilization rate of mice

注:与空白对照组相比,*代表显著差异P<0.05,**代表极显著差异P<0.01;与模型对照组相比#代表显著差异P<0.05,##代表极显著差异P<0.01;表2～表6同。

2.2 唾液酸对小鼠SOD活力的影响

小鼠血清和肝脏中SOD活力结果见表2。与空白对照组相比,模型组血清和肝脏中SOD活性均显著降低(P<0.01),表明实验造模成功。与模型组相比,中剂量组血清和肝脏中SOD活性均提升显著(P<0.05)。

表2 唾液酸对小鼠抗氧化酶SOD活力的影响Table 2 Effects of sialic acid on activity of SOD in mice

2.3 唾液酸对小鼠GSH-Px活力的影响

由表3可知,与空白对照组相比,模型组小鼠血清中GSH-Px活性显著降低(P<0.05),肝脏中极显著降低(P<0.01),表明实验造模成功。在血清中高剂量组较模型组酶活性提升显著(P<0.01),但肝脏中各剂量组GSH-Px活力较模型组未见显著差异(P>0.05)。

表3 唾液酸对小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影响Table 3 Effects of sialic acid on activity of GSH-Px in mice

2.4 唾液酸对小鼠GSH 含量的影响

如表4所示,模型组血清和肝组织中GSH的含量显著低于空白对照组(P<0.01),表明造模成功;唾液酸各剂量组小鼠血清中GSH含量均显著高于模型组(P<0.05),但在肝脏中,各剂量组GSH含量较之模型组未见显著差异(P>0.05)。

表4 唾液酸对小鼠GSH含量的影响Table 4 Effects of sialic acid on the content of GSH in mice

2.5 唾液酸对小鼠MDA含量的影响

由表5可知,与空白对照组相比,模型组血清和肝脏中MDA含量极显著增加(P<0.01),表明实验造模成功。血清中唾液酸中、高剂量组MDA 含量极显著低于模型组(P<0.01),而肝脏中,各剂量组相对于模型组MDA有所降低,但未见显著差异(P>0.05)。

表5 唾液酸对小鼠MDA含量的影响Table 5 Effects of sialic acid on MDA in mice

2.6 唾液酸对小鼠肝组织PC含量的影响

由表6可知,模型组小鼠肝脏中PC含量显著高于空白对照组(P<0.01),表明实验造模成功。唾液酸各剂量组小鼠肝脏中PC含量均低于模型组,但仅中剂量组含量显著降低(P<0.05)。

表6 唾液酸对小鼠蛋白质羰基含量的影响Table 6 Effects of sialic acid on PC content in mice

3 讨论与结论

本研究以小鼠机体非酶系抗氧化物GSH含量、抗氧化酶系SOD、GSH-Px活性及氧化损伤典型产物PC和MDA含量为检测指标,探究唾液酸对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用。结果显示模型组较空白组SOD、GSH-Px酶活性、GSH含量显著降低,PC及MDA含量显著提升,表明本实验急性肝损伤小鼠造模成功。唾液酸剂量组较模型组,GSH、GSH-Px(给药60 mg/kg·bw唾液酸)及MDA在血清中表现出了显著性差异,给药30 mg/kg·bw唾液酸后PC含量在肝组织中显著降低,而给药30 mg/kg·bw唾液酸后抗氧化酶系SOD在血清和肝组织中均有显著提升,表明受试物唾液酸具有保护抗氧化损伤作用。

机体在急性酒精暴露下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加或抗氧化酶活性降低。ROS如超氧阴离子自由基、羟基自由基和H2O2在能量转换过程中不断产生,同时生物体处于氧化应激状态[15]。受试物对急性酒精诱导的氧化损伤模型小鼠的保护作用可能是通过提升小鼠体内抗氧化酶系活性、清除体内自由基、降低氧化应激产物含量等途径实现的。

GSH与谷胱甘肽-S-转移酶和GSH-Px结合,在细胞对ROS的防御机制中起着十分重要的作用[17]。本研究结果中唾液酸各干预组GSH含量均有显著提升,表明唾液酸对于酒精诱导的急性氧化应激保护作用可能是由于GSH氧化还原平衡调节的结果,推测唾液酸在保护细胞免受ROS施加的自由基应激中起到关键作用。

相关研究表明酒精的大量摄入会改变体内的脂质平衡并导致脂质过氧化产物如MDA的大量生成[18]。本实验结果表明唾液酸中、高剂量组血清中MDA含量较模型组均有显著降低。相关研究证实NANA可以通过与H2O2反应的相同方式降低脂质氢过氧化物的细胞毒性[19]。何培元等12]实验结果与本实验中作为燕窝重要功能成分的唾液酸结论相符。此外,PC含量也是氧化应激的重要标志之一,是评估细胞氧化损伤程度及衡量自由基对机体的损伤的重要手段[20]。本实验中唾液酸中剂量组PC含量较之模型组显著降低,推测唾液酸可以通过与自由基结合保护机体中蛋白质,避免酒精急性氧化应激造成的分子羰基化修饰。

不同剂量的唾液酸干预对抗氧化剂及氧化应激产物的作用呈现出不同效果,提示唾液酸干预可以在一定程度上整体改善机体氧化应激水平,而这种改善效应具有一定的剂量依赖性。中剂量组的抗氧化防御效果最好。但未能观察到显著的剂量-效应关系。因此推测一定剂量的唾液酸干预具有抗氧化作用,但存在适宜的剂量范围。

本研究通过聚焦外源性唾液酸的补充对于氧化应激的保护作用,为唾液酸保肝护肝相关功能性产品开发提供新思路,目前本研究还存在着许多问题,需要进一步开展深入的机制研究,以探索其具体改善氧化损伤介导的肝损伤机制。此外,仍需进一步的人群实验,开展相关干预性研究,以验证唾液酸的保肝护肝功能。