精胺氧化酶抑制剂SI-4650抑制人恶性黑素瘤A375细胞增殖的分子机制研究

周游 王艳林 曹春雨 孙丽丹 杨建林

三峡大学医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北宜昌 443002

近年研究发现，肿瘤细胞中的总多胺含量显著高于正常细胞［1］，多胺水平的异常升高促进肿瘤生长和侵袭转移，而多胺的耗竭则能抑制肿瘤细胞增殖，由此多胺代谢途径已经成为肿瘤防治和抗癌药物设计的分子靶点［2-3］。精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）是多胺分解代谢的关键酶，以精胺（spermine）为底物，将其氧化为精脒（spermidine），同时生成 3-氨基丙醛和 H2O2［4-5］。研究证实，SMO表达异常导致的多胺代谢紊乱与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展密切相关［6］。我们前期运用基于药效团的计算机辅助药物设计技术和高通量虚拟筛选技术，获得了一种靶向SMO 的新型小分子抑制剂SI-4650，通过分子和细胞水平实验证实，SI-4650可通过抑制SMO活性，干扰细胞多胺代谢，诱导人神经胶质瘤U87MG 细胞和骨肉瘤143B 细胞发生凋亡和自噬性死亡［7-8］。恶性黑素瘤是一种高度恶性的皮肤肿瘤，具有易早期转移、致死率高、对化疗药物不敏感等特点。本研究探索SI-4650对人恶性黑素瘤A375细胞增殖和多胺代谢的影响及其可能的分子机制，以期为恶性黑素瘤临床治疗药物的开发提供新思路。

材料与方法

一、主要试剂与细胞

SI-4650（荷兰 Specs 公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma 公司）；DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清、青霉素/链霉素双抗（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；RIPA蛋白裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；自噬小体标记蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ抗体（美国CST 公司）；促凋亡蛋白Bax抗体、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗体、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抗体、自噬相关蛋白Beclin-1抗体（美国Proteintech Group 公司）；β 肌动蛋白抗体（北京科美博瑞科技有限公司）；辣根酶标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；荧光标记的LC3 质粒（pEGFP-LC3，美国Add Gene 公司）；ECL超敏显影液（美国Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；细胞膜荧光探针DIOC6（3）（美国Thermo Fisher 公司）。人恶性黑素瘤A375 细胞购于中国科学院细胞库（上海），由肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代保存。

二、方法

1.MTT 法检测 SI-4650 对 A375 细胞增殖的影响：取对数生长期A375细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔1.0 × 103个细胞，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，同时设未添加细胞的空白培养孔，弃培养基（未特殊说明时为含10%胎牛血清的DMEM 培养基），换用含终浓度为0、10、20、40、80、160 μmol/L SI-4650 的培养基继续培养，每个药物浓度设置4 个复孔。分别继续培养24、48、72 h后，弃培养基，每孔加MTT试剂200 μl（终浓度0.2 g/L），于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h 后，弃MTT 试剂，每孔以 150 μl DMSO 充分溶解，使用酶标仪于490 nm 波长处检测每孔吸光度（A值）。A375 细胞的生长抑制率 =［1-（实验组A值 - 空白组A值）/（阴性对照组A值- 空白组A值）］×100%。

2.SI-4650 预处理 A375 细胞：根据 SI-4650 对A375 细胞的生长抑制率筛选SI-4650 处理A375 细胞的时间及浓度。后续实验使用0（对照组）、40、80 μmol/L SI-4650 处理48 h的A375细胞。

3.化学发光法分析A375 细胞内SMO 的活性：收集上述各组A375细胞，分别以200 μl 0.083 mol/L甘氨酸缓冲液（pH 8.0）浸润后置于-80 ℃冰箱，于低温状态冻融裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min，离心10 min（本文涉及离心时离心半径均为10 cm），取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。每组样本取总蛋白含量相同的细胞裂解液，参照文献［9］配制酶反应体系，以化学发光法检测蛋白上清液中SMO 的活性，酶活性以单位总蛋白质量（mg）、单位时间（s）内的化学发光强度（RLU）表示。

4.高效液相色谱（HPLC）分析A375 细胞内多胺水平：收集上述各组A375细胞，以800 μl裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液，BCA法测定总蛋白浓度。每组样本取总蛋白含量相同的细胞裂解液，双蒸水补至800 μl，加入10 μl 苯甲酰氯、20 μl 1 mmol/L DAH（内标分子）、500 μl 2 mol/L NaOH，涡旋 30 s，40 ℃水浴 20 min后，混入2 ml 饱和NaCl 溶液终止反应。采用2 ml乙醚萃取反应液，取上层乙醚液，反复萃取3 次后合并上层乙醚液，通风橱中挥发至干，1 ml 甲醇溶解标本后，经0.2 μm微孔滤膜过滤至样品瓶中，以Waters-e2695 高效液相色谱分析仪分析。色谱分析条件：Luna C18色谱柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm）为固定相，乙腈-水（38∶62）为流动相，流速1 ml/min，柱温30 ℃，检测波长设为254 nm，以单位细胞总蛋白（1 mg）中多胺浓度表示相对多胺含量。

5.流式细胞仪检测A375 细胞周期：收集上述各组 A375 细胞，室温 1 000 r/min 离心 3 min 后，弃上清液，以1.5 ml预冷75%乙醇重悬细胞，4 ℃固定过夜。室温1 000 r/min离心5 min后，弃上清液，以1.5 ml 1×PBS洗涤细胞，室温1000 r/min离心5 min弃上清液。以500 μl结合缓冲液（含0.1%TritonX-100和50 μg/L RNase）重悬细胞后，加入 20 μl 0.5 g/L碘化丙锭（propidium iodide，PI），37 ℃水浴锅中避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

6.流式细胞仪检测A375 细胞凋亡：收集上述各组 A375 细胞，室温 1 000 r/min 离心 3 min 后，弃上清液。以100 μl 结合缓冲液重悬细胞，每样以5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混匀后染色，避光条件下25 ℃孵育15 min，再以400 μl 结合缓冲液重悬混匀后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

7.流式细胞仪检测A375细胞线粒体膜电位情况：收集上述各组A375细胞，无血清DMEM培养液洗涤，室温1 000 r/min离心3 min后，弃上清液。用无血清DMEM 培养液以2 000∶1 比例稀释DIOC6（3）母液，取1 ml DIOC6（3）重悬细胞，37 ℃孵育20 min。室温 1 000 r/min 离心 5 min 后，弃上清液，用1 ml 无血清DMEM 培养液洗涤细胞3 次后，以500 μl 1 × PBS 重悬混匀，流式细胞仪检测DIOC6（3）探针的绿色荧光。细胞中单体DIOC6（3）绿色荧光强度越高，线粒体膜电位越低。

8.荧光显微镜观察A375 细胞内自噬小体的形成情况：取对数生长期A375 细胞悬液，按1.5 ×105个/孔接种于6 孔板中，培养至细胞融合度约80%时，取2 μg 携带绿色荧光蛋白GFP 和外源性LC3 的质粒（pEGFP-LC3 质粒）加入400 μl 无血清DMEM 培养基中混匀，再加入 4 μl TurboFect 转染试剂，充分混匀并静置20 min，随后将上述混合液逐滴加入细胞培养孔中，继续培养24 h，换用含0（对照组）、40、80 μmol/L SI-4650 的 DMEM 培养基培养48 h，倒置荧光显微镜下观察自噬小体标记物LC3重组绿色荧光蛋白的胞内聚集情况，分析A375细胞中自噬小体的形成情况。

9.Western印迹法检测A375细胞凋亡、自噬相关蛋白表达：收集上述各组A375 细胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液，BCA 法测定总蛋白浓度。每组样本取总蛋白质量均为60 μg 的上清液，经电泳、转膜、封闭后，以对应一抗于4 ℃孵育过夜，再以对应二抗室温孵育2 h，采用ECL化学发光法显影并记录结果，以目的蛋白与内参β 肌动蛋白灰度值之比反映目的蛋白相对水平。

10.统计学方法：采用SPSS 13.0 软件，计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SI-4650抑制A375细胞增殖

见图1。不同浓度SI-4650 及不同处理时间的A375 细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F=977.23、5.16，P＜0.05）。SI-4650处理A375细胞48 h，对细胞的IC50 值为（90.48 ± 6.99）μmol/L，各浓度组间细胞增殖抑制率差异有统计学分意义（F=244.16，P＜ 0.05），40、80 μmol/L SI-4650 组抑制率与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001）。

二、SI-4650对A375细胞内SMO活性、总多胺含量的影响

对照组、40 μmol/L 组、80 μmol/L 组 A375 细胞SMO 的酶活性差异有统计学意义（P＜ 0.001），40、80 μmol/L组活性低于对照组（P＜ 0.01），80 μmol/L组活性低于40 μmol/L 组（P＜ 0.05）。3 组腐胺、精脒、精胺、总多胺含量差异均具有统计学意义（均P＜ 0.001），40、80 μmol/L 组多胺含量均低于对照组（均P＜ 0.01）。见表1。

三、SI-4650对A375细胞周期的影响

对照组、40 μmol/L 组、80 μmol/L 组 A375 细胞G0/G1期、S期、G2/M期比例差异有统计学意义（均P＜ 0.05），40、80 μmol/L 组细胞 G0/G1、G2/M 期细胞比例低于对照组（P＜0.05），S期细胞比例高于对照组（P＜0.01）。见表2。

四、SI-4650对A375细胞凋亡的影响

图1 MTT法检测精胺氧化酶抑制剂SI-4650对人恶性黑素瘤A375 细胞增殖的影响 随着SI-4650 浓度的增加和作用时间的延长，A375细胞抑制率逐渐增加。a：与对照组相比，P ＜0.01。n=4

表1 不同浓度精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞精胺氧化酶活性、多胺含量的影响（）

注：n=3。a 与对照组相比，P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）多胺含量（mg/L） 精胺氧化酶活性（RLU）0（对照组）40 80 F值P值腐胺0.55±0.02 0.32±0.04a 0.25±0.01a 109.30＜0.001精脒1.31±0.01 0.88±0.01a 0.67±0.01a 10029.27＜0.001精胺2.17±0.02 1.97±0.01a 1.88±0.01a 338.02＜0.001总多胺4.03±0.01 3.18±0.03a 2.81±0.01a 2931.07＜0.001 159307.17±9138.16 61432.85±2620.92a 43337.35±1221.25a 242.58＜0.001

表2 不同浓度精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞周期、凋亡细胞比例及细胞中单体DIOC6（3）绿色荧光强度的影响（）

表2 不同浓度精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞周期、凋亡细胞比例及细胞中单体DIOC6（3）绿色荧光强度的影响（）

注：n=3。与对照组相比，a P ＜ 0.05，b P ＜ 0.01

SI-4650（μmol/L）0（对照组）40 80 F值P值细胞周期比例（%）G0/G1期76.87±2.52 70.68±0.69a 65.78±0.28b 26.74＜0.01 S期15.63±2.48 27.61±2.05b 31.58±1.45b 31.66＜0.001 G2/M期7.50±1.55 3.11±1.56a 2.64±1.18a 6.91＜0.05凋亡细胞比例（%）5.20±0.46 7.59±0.63b 20.14±2.27b 100.68＜0.001 DIOC6（3）荧光强度1 311.67±40.47 2 029.00±56.20b 2 950.67±48.03b 570.22＜0.001

流式细胞仪检测结果显示，对照组、40 μmol/L组、80 μmol/L 组A375细胞凋亡比例差异有统计学意义（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 组凋亡比例高于对照组（P＜ 0.05）。单体DIOC6（3）的绿色荧光峰值显示，3 组细胞荧光强度差异有统计学意义（F=20.73，P＜ 0.01），40、80 μmol/L 组细胞荧光强度高于对照组（P＜ 0.05）。见表2，图2、3。

Western 印迹法显示，3 组间促凋亡蛋白Bax、凋亡降解标志蛋白c-PARP、凋亡抑制蛋白Bcl-2水平差异均有统计学意义（P＜ 0.001），40、80 μmol/L组细胞Bax、c-PARP 水平高于对照组（P＜ 0.001，P＜ 0.05），Bcl-2 水平低于对照组（P＜ 0.001）。见表3、图4。

五、SI-4650对A375细胞自噬的影响

倒置荧光显微镜观察结果示，对照组细胞中荧光蛋白呈弥散性均匀分布，40 μmol/L 组细胞出现斑点状聚集荧光，80 μmol/L 组细胞聚集荧光斑点更多（图5A）。Western 印迹法显示，对照组、40 μmol/L组、80 μmol/L组A375细胞内自噬相关标志蛋白Beclin-1 和自噬微管蛋白LC3-Ⅱ水平差异有统计学意义（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 组细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ水平均高于对照组（P＜ 0.01）。见图5B。

图2 流式细胞仪检测精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞的影响 40、80 μmol/L SI-4650组细胞凋亡比例高于对照组

图3 流式细胞仪检测精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）作用于人恶性黑素瘤A375 细胞后单体DIOC6（3）绿色荧光强度 40、80 μmol/L SI-4650组荧光强度高于对照组，提示线粒体膜电位低于对照组

图4 Western印迹法检测精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375 细胞凋亡影响 40、80 μmol/L SI-4650 组促凋亡蛋白Bax、凋亡降解标志蛋白c-PARP水平高于对照组，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平低于对照组

表3 不同浓度精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞凋亡、自噬蛋白水平的影响（）

表3 不同浓度精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞凋亡、自噬蛋白水平的影响（）

注：n=3。与对照组相比，a P ＜ 0.01，b P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）0（对照组）40 80 F值P值凋亡相关蛋白水平自噬相关蛋白Bax 0.32±0.04 0.83±0.12a 1.18±0.16a 35.51＜0.001 Bcl-2 1.03±0.25 0.65±0.09b 0.12±0.002b 27.54＜0.001 Bax/Bcl-2 0.33±0.17 1.28±0.12b 8.98±1.38b 104.85＜0.001 c-PARP 0.18±0.005 0.32±0.002b 0.79±0.035b 730.11＜0.001 Beclin1 0.66±0.006 1.00±0.007a 1.14±0.003b 35.87＜0.001 LC3-Ⅱ0.20±0.001 0.31±0.00002a 0.98±0.003b 425.04＜0.001 LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ12.98±0.005 3.13±0.003b 0.90±0.001b 424.89＜0.001

图5 精胺氧化酶抑制剂（SI-4650）对人恶性黑素瘤A375细胞自噬的影响 5A：倒置荧光显微镜下观察（×1 200），SI-4650 处理转染了自噬小体标记蛋白LC3荧光质粒的A375细胞后，40 μmol/L组细胞中出现斑点状聚集荧光，80 μmol/L 组聚集荧光斑点更多；5B：Western 印迹法显示，40、80 μmol/L SI-4650 组细胞自噬相关标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平高于对照组

讨 论

SMO 表达异常导致多胺代谢紊乱与包括肿瘤在内的多种疾病的病理进程密切相关［2，6］。研究证实，SMO 高表达是导致肺癌、前列腺癌及胃肠道癌症等恶性肿瘤发生发展的重要诱发因素［10-11］。恶性黑素瘤恶性程度高，预后极差。我们的前期研究设计了一种靶向SMO 的新型小分子抑制剂SI-4650，本文探索了SI-4650 对人恶性黑素瘤A375细胞增殖和多胺代谢的影响。

本研究发现，SI-4650 能有效抑制A375 细胞的增殖，在共培养48 h 条件下的IC50 为90.48 ±6.99 μmol/L，随SI-4650作用时间延长和剂量增大，抑制效应也随之增加。并可诱导A375细胞周期阻滞在S期。SMO作为多胺分解代谢的关键酶，可以将精胺氧化为精脒，同时产生3-氨基丙醛和H2O2［4-5］。本研究发现，SI-4650能有效抑制A375细胞中SMO 的酶活性，且酶活性随药物浓度增加而降低；HPLC分析发现，经SI-4650处理后，SMO酶促反应催化产物精脒含量随着药物浓度的增加而逐渐减少，总多胺含量也显著下降，但SMO催化反应底物精胺含量并未发生相应的升高，可能的原因为SMO酶活性的抑制导致多胺降解代谢受阻，精胺通过精脒/精胺N1 乙酰基转移酶（SSAT）的催化转变为乙酰化精胺，通过肿瘤细胞膜表面高表达的多胺转运载体直接排出细胞外［12-13］，使得细胞内并未出现精胺的积累。由此证实SI-4650 作为SMO 的抑制剂，有效抑制A375 细胞内的SMO 酶活性，进而影响SMO 催化精胺的转化，干扰A375 细胞正常的多胺代谢进程，降低细胞内总多胺含量，从而抑制A375细胞的增殖。

本研究发现，SI-4650干预后可使A375细胞凋亡比例升高，同时Western 印迹法显示，A375 细胞内的促凋亡蛋白Bax表达上调，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2 比值显著升高，细胞内凋亡降解标志蛋白c-PARP水平增高。同时利用荧光染料DiOC6（3）检测发现，细胞线粒体膜电位显著降低。提示SI-4650 作用A375 细胞后，可引起Bax、Bcl-2 表达改变导致的跨线粒体膜孔形成，线粒体膜电位下降，膜通透性增加，从而释放凋亡因子，通过线粒体途径诱导A375细胞发生凋亡。

细胞凋亡和细胞自噬分别称为Ⅰ型、Ⅱ型程序性细胞死亡，探究细胞凋亡和自噬在抗肿瘤效应中发挥的作用及其相关分子机制为当前的研究热点之一。诱导黑素瘤自噬可有效抑制其生长，可能达到治疗的目的［14-16］。本研究发现，SI-4650 干预A375细胞后，坏死细胞数量显著增多，提示SI-4650抑制A375 细胞增殖的机制不仅为诱导细胞凋亡。进一步实验证实，SI-4650还可诱导A375细胞发生自噬性死亡。本研究采用SI-4650 处理预先转染LC3 荧光蛋白基因的A375 细胞后，细胞内的荧光信号由弥散状向斑点聚集状转化，提示SI-4650 处理使A375 细胞内LC3 蛋白聚集到了自噬小体上。自噬激活相关蛋白Beclin-1 是形成自噬体的关键分子之一，与多种蛋白相互作用共同调控自噬体的形成与成熟；LC3-Ⅱ作为自噬体形成的特异性分子标记物，与自噬小体的数量密切相关，由LC3-Ⅰ在自噬发生过程中转化而来［17-19］。本研究显示，SI-4650 干预后A375 细胞中自噬激活相关蛋白Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表达增多，这些结果均提示SI-4650可诱导A375细胞发生自噬性死亡。

综上，本研究证实，SI-4650具有抑制人恶性黑素瘤A375 细胞增殖的药理活性，其机制可能与影响细胞周期、干扰细胞内多胺代谢和诱导细胞凋亡以及自噬性死亡相关，提示SI-4650 在人恶性黑素瘤治疗及研究中的潜在应用价值。但鉴于黑素瘤的高转移性和药物靶向性是肿瘤患者临床治疗的难点之一，因此SI-4650对A375细胞的侵袭迁移以及正常黑素细胞的影响尚需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突