低深度全基因组测序拷贝数变异检测技术对缺失型X连锁鱼鳞病的检测效力及意义的分析研究

白周现 陈晨 苏利沙 徐慧 王聪慧 时盼来 孔祥东

郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心 450000

鱼鳞病是一组皮肤角化障碍性疾病，主要表现为四肢伸侧或躯干部皮肤干燥、粗糙，伴有菱形或多角形鱼鳞状脱屑，多为遗传因素所致。X连锁鱼鳞病（X-linked ichthyosis，XLI）由类固醇硫酸酯酶基因（STS）缺失或突变引起，鳞屑颜色深浅不一，深棕色鳞屑患者约占70%，浅灰色鳞屑患者占30%［1］。男性 XLI 发病率为 1/1 300 ～ 1/1 500［2］。85% ～90% XLI 病例为包括 STS 基因在内的Xp22.31 片段缺失型，其余为STS 单基因突变型［3］。一般通过高通量测序、定量PCR（qPCR）及Sanger测序等进行XLI的遗传诊断。我们通过分析郑州大学第一附属医院2018年所有进行拷贝数变异（copy number variation，CNV）检测的案例，探讨低深度全基因组测序CNV 检测技术（CNV-Seq）在缺失型XLI遗传诊断和产前诊断中的应用。

对象与方法

一、研究对象

收集2018全年于郑州大学第一附属医院进行CNV 检测的 3 616 例受试者，其中孕妇 2 891 例，其他725 例，以及进行鱼鳞病单基因检测的7 例鱼鳞病患者或家系的表型资料和遗传检测结果。2 891例孕妇产前检测样本主要为羊水，部分为胎儿绒毛，极少数为脐血样本，725例其他受试者检测样本为外周血。3 616例受试者中，6例孕妇的胎儿样本检出缺失型XLI 阳性，这6 例受试者皆因鱼鳞病家族史以外的临床指征行羊水穿刺CNV检测。经询问鱼鳞病家族史和临床表现，6 个家系情况见图1。本研究获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准（批件号：KS-2018-KY-36），受试者签署知情同意书后进行采样检测，胎儿父母验证实验采集胎儿父母的外周血进行实验。

二、方法

1.羊水细胞和外周血DNA 提取：使用纯化柱法（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国 QIAGEN 公司）提取羊水细胞基因组DNA。使用磁珠法提取试剂盒（Blood DNA Midi Kit D3494，美国Omega Bio-tek公司）和自动化DNA提取设备（艾本德中国有限公司）抽提外周血基因组DNA。

2.CNV-Seq检测：使用商品化CNV检测文库构建试剂盒（北京贝瑞和康生物技术有限公司），通过本科室Illumina 测序平台NextSeq 500 检测CNVs。测序类型SE45（单端测序，读长45 bp），平均测序深度0.1X。人类基因组参考序列版本选择GRCh37（UCSC 数据库，http：//genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway）。采用 Tattini 等［4］的 CNV 检测算法分析测序数据，检出CNVs分辨率为100 kb以上。

3.qPCR 法验证 CNV：以 5 例孕妇羊水、1 例携带者母亲、1 例健康女性对照的基因组DNA 为模板，采用GeneTool 软件自行设计的特异引物（表1）和荧光定量试剂盒（KAPA SYBR®FAST Universal kit，美国Kapa Biosystems公司）于QuantStudio5 PCR仪（美国ThermoFisher 公司）对目标序列进行实时定量检测。STS基因共10个外显子，选取第1、5、10外显子代表整个基因。

4.染色体微阵列法验证CNV：使用Affymetrix平台Cyto Scan 750k型号芯片独立验证检出的CNV。750k芯片包含两种设计原理的探针：200 436个单核苷酸多态性（SNPs）探针和550 000个CNV探针，分别采用SNP 微阵列和比较基因组杂交（CGH）微阵列原理。应用配套软件ChAS-3.2 分析微阵列原始数据。

5.CNV 致病性分析：CNVs 的注释分析主要参考人群多态性数据库DGV（database of genomic variants，http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、病例数据库 DECIPHER（database of genomic variation and phenotype in humans using ensembl resources，https：//decipher.sanger.ac.uk）和人类孟德尔遗传在线数据库OMIM（online Mendelian inheritance in man，https：//omim.org）。同时参考基因剂量效应数据库 ClinGen（clinical genome resource，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen）分析拷贝数缺失、重复的意义。

6.7 例鱼鳞病患者或家系的CNV 检测：对2018 年收集的7 例鱼鳞病患者使用鱼鳞病基因包（panel）引物混合物（由北京迈基诺基因科技股份有限公司合成）靶向捕获测序技术，通过本中心Illumina NextSeq 500测序平台进行高通量测序，人类基因组参考序列版本选择GRCh37。经基因靶向捕获测序发现，其中2例为缺失型XLI患者，对这2例患者进行CNV-Seq 检测以分析染色体片段CNV情况，验证CNV-Seq检测技术在该单基因遗传病中的诊断意义。

结 果

一、CNV-Seq检测

3 616 例受试者CNV 检测全部成功，成功率为100%，检测结果显示，6 例（1.66‰）Xp22.31 缺失（含STS主效基因），见表2。经家系验证发现，其中2 例（家系1、2）为自发突变，1 例（家系5）为父源遗传，3 例（家系3、4、6）为母源遗传；家系1、2、3、5、6的胎儿羊水Xp22.31缺失结果和家系4孕妇的验证结果见图2。

2018 年在我院进行CNV 检测的3 616 例受试者中发现Xp22.31重复（与Xp22.31缺失相同位置，含STS 主效基因）16 例（4.42‰），包括11 例女性为Xp22.31 三倍重复，5 例男性为 Xp22.31 二倍重复（图3）。16例Xp22.31重复案例中4例为正常表型成人或儿童，12例为胎儿，其中5例Xp22.31重复胎儿进行了父母来源验证，结果均遗传自正常表型父亲或母亲。

二、qPCR法验证CNV检测结果

图1 6个X连锁鱼鳞病（XLI）家系谱图 家系5中Ⅲ3为猫叫综合征患儿；家系1、2只追踪到2代人，受试者经随访否定鱼鳞病家族史

表1 定量PCR（qPCR）中类固醇硫酸酯酶（STS）基因外显子的引物设计

表2 6个X连锁鱼鳞病（XLI）家系Xp22.31缺失拷贝数变异（CNV）检测结果

图2 6个X连锁鱼鳞病（XLI）家系致病缺失区域拷贝数变异（CNV）测序结果 A、B、C、D、E分别为家系1（胎儿Ⅱ2）、5（胎儿Ⅲ4）、2（胎儿Ⅱ1）、3（胎儿Ⅲ1）、6（胎儿Ⅳ1）的产前诊断结果，F 为家系4 的孕妇验证结果，红色方框内为拷贝数异常区域，其他区域拷贝数正常，显示Xp22.31片段缺失

图3 拷贝数变异（CNV）检测显示部分受试者存在包含类固醇硫酸酯酶（STS）基因的Xp22.31 片段重复3A：女性受试者；3B：男性受试者，红色方框内为拷贝数异常区域，其他区域拷贝数正常，显示Xp22.31片段重复

采用qPCR 法验证6 例产前CNV 检测为Xp22.31缺失阳性的结果，显示家系5 Ⅲ4女性胎儿为STS 基因完全杂合缺失携带者，家系1、2、3、4、6中男性胎儿STS基因完全缺失。qPCR结果与CNV测序结果一致，见图4。

三、染色体微阵列验证

选取家系5 中Ⅲ4 女性胎儿杂合Xp22.31 缺失携带者进行SNP-CGH 染色体微阵列法验证，Affymetrix 750k 微阵列结果为 arr［hg19］Xp22.31（6 473 896-8 061 665）× 1，与CNV 测序结果一致，见图5。可知CNV-Seq 技术对CNV 检测可以达到与传统芯片技术一样的效力。

四、CNV致病性分析

图4 定量PCR 验证6 例产前拷贝数变异（CNV）检测诊断Xp22.31 缺失阳性胎儿的类固醇硫酸酯酶（STS）基因缺失情况1 ～ 6分别为家系1（胎儿Ⅱ2）、5（胎儿Ⅲ4）、2（胎儿Ⅱ1）、3（胎儿Ⅲ1）、6（胎儿Ⅳ1）和4（胎儿Ⅲ1）；家系5 Ⅲ4女性胎儿为STS基因完全杂合缺失携带者，家系1、2、3、4、6中男性胎儿STS基因完全缺失

本研究检出的6 例Xp22.31 缺失片段大小从500 kb至1.7 Mb，均含有XLI的STS主效基因，另有若干其他无明确致病意义的OMIM 基因。CNV 人群多态性数据库DGV（截至2019年7月25日）未收录Xp22.31缺失案例，病例数据库DECIPHER（更新至 2018 年 5 月 23 日）收录了 3 例 Xp22.31 缺失致病的病 例 ，这些 病例（DECIPHER ID：326575，289553，326575）均表现为先天性鱼鳞病且致病性明确。本研究检出的Xp22.31 缺失片段覆盖DECIPHER收录的STS缺失型XLI综合征区域。根据基因剂量效应数据库ClinGen 记录，STS 为单倍剂量不足效应（haploinsufficiency）基因，具有足够的剂量致病性证据（haploinsufficiencyscore 3）。因此，判断Xp22.31缺失（含STS）为致病性CNV。

本研究同时也检出16 例Xp22.31 重复，与Xp22.31 缺失位置相同，大小约1.6 Mb。DGV 数据库未收录Xp22.31 重复案例，DECIPHER 数据库亦无类似明确致病的案例收录。无证据表明STS 为3 倍 剂 量 敏 感 效 应（triplosensitivity）基 因（triplosensitivityscore 0）。16 例 Xp22.31 重复的男性和女性携带者均表型正常，经家系验证的胎儿父母之一携带该重复亦表型正常。结合个体表型，分析认为，Xp22.31重复为多态性变异的可能性大。

五、鱼鳞病基因突变检测情况

图5 单核苷酸多态性-比较基因组杂交染色体微阵列法验证家系5女性胎儿产前拷贝数变异（CNV）诊断结果 5A：局部放大图；5B：全局图。红色方框内为拷贝数异常区域，其他区域拷贝数正常

2018 年郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心7例鱼鳞病患者的鱼鳞病基因panel 检测结果见表3。结果显示，丑角样鱼鳞病1例，寻常型鱼鳞病2 例，XLI 3 例，未找到致病基因突变1 例。对缺失型 XLI 患者 5 和患者 7 行 CNV 测序分析，显示2例患者均存在基因拷贝数异常，患者5的Xp22.31（6 480 000-7 860 000）存在1.38 Mb半合子缺失（含STS基因），患者7的Xp22.31（6 820 000-7 720 000）存在0.9 Mb半合子缺失（含STS基因），见图6。

讨 论

通常情况下对鱼鳞病的遗传诊断采用皮肤病相关基因panel，通过靶向捕获高通量测序法进行致病基因突变筛查［6］。2015 年有研究者［7］通过CNV-Seq 法检测到母体X 染色体Xp22.31 片段（含STS 基因）拷贝数异常与无创产前DNA 检测技术（NIPT）检测到的胎儿性染色体非整倍体假阳性有关。我们通过对本中心CNV 检测结果中含STS 基因Xp22.31 片段缺失阳性案例的整理，探讨CNVSeq 检测技术对STS 缺失型XLI 的诊断适用性和意义。

本中心2018 年3 616 例进行CNV 检测的受试者中，共检出6例Xp22.31片段缺失阳性，其中男性胎儿5例、女性胎儿1例。CNV检测发现的6个XLI家系，皆因无鱼鳞病在内的临床指征不适合作单基因病遗传诊断，而行产前筛查或诊断，经电话随访获知家系5 和家系6 有鱼鳞病家族史，其余4 个家系均否认家族史。经分子生物学实验验证，家系1和家系2 为胎儿自发突变，其余4 个家系为亲代遗传。其中家系5 因猫叫综合征患儿生育史而做产前诊断，该胎儿经CNV 检测排除猫叫综合征患病可能性，意外发现为鱼鳞病Xp22.31片段缺失携带者。这6 个XLI 家系胎儿，其中4 例因无创检测提示X 染色体异常可能而行羊水穿刺产前诊断，另2 例因其他不良生育史或唐氏筛查高风险而行产前诊断。CNV-Seq 检出的XLI阳性结果与qPCR和SNP-CGH微阵列2种方法独立验证结果一致，这与以往研究［8］认为全基因组测序法检测拷贝数异常的可靠性符合。此外，在这3 616例行CNV检测的受试者中，我们发现Xp22.31 重复（含STS 基因）携带率4.42‰，综合分析认为，该片段重复为多态性变异。因此，CNV-Seq 检测技术可应用于缺失型XLI的基因诊断及产前诊断，并且该技术能够同时对全基因组范围内的拷贝数异常进行筛查。

本中心2018 年7 例因鱼鳞病进行遗传学诊断的案例中，有 3 例 STS 基因突变致 XLI，其中 2 例为STS完全缺失型。在这7例鱼鳞病患者中，我们发现了3 例新发候选致病性变异，其中患者1 为引产胎儿，外院根据临床表现诊断为鱼鳞病，本中心检测到高度相关的ABCA12基因c.490delA（p.I164Ffs*8）移码突变和39-42 号外显子缺失组合的复合杂合突变，依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南［9］，判断为致病性变异（等级PVS1），但该突变的致病性仍需进一步的功能验证或家系携带验证。患者4 为丝聚合蛋白（FLG）基因c.10969C＞T（p.R3657X）和c.3321delA（p.G1109Efs*13）［5］复合杂合突变导致的寻常型鱼鳞病，其中p.R3657X 无义突变为新发变异且具致病性（等级PVS1）；患者6存在 STS 基因 c.923A＞G（p.Y308C）错义突变导致XLI 的可能性。应用CNV-Seq 技术对STS 缺失型XLI 患者进行遗传诊断得到的结果与基因Panel 测序法一致。

表3 2018年郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心7例鱼鳞病患者基因诊断概况

图6 缺失型X连锁鱼鳞病（XLI）患者5和患者7拷贝数变异（CNV）测序 红色方框内为拷贝数异常区域，其他区域拷贝数正常，患者5和7存在Xp22.31片段缺失

XLI 是一种较为常见的皮肤角化障碍性疾病，STS缺失型为该病的主要致病形式。缺失型XLI具有临床表现异质性，鱼鳞病皮损表现从轻微到严重程度不一，极少数可能会合并其他全身症状。缺失型XLI 的产前基因检测能够对该病在胎儿期进行及早诊断，但由于该病的临床表现异质性和遗传异质性，相关遗传咨询需谨慎。对有遗传家族史的胎儿可结合家系内患者表型综合分析，对新发突变的受检胎儿应对孕妇进行充分的风险告知。

总之，本研究探讨了CNV-Seq检测技术在缺失型XLI 的基因诊断及产前诊断中应用的可靠性以及检出情况。报告了新的单中心XLI相关Xp22.31片段缺失的人群频率（1.66‰）和相同位置的Xp22.31 片段重复的人群频率（4.42‰），综合分析认为Xp22.31片段重复为多态性变异。CNV-Seq技术能够稳定、可靠、快捷地检出缺失型XLI变异，为XLI的诊断及遗传咨询提供了新途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突