对微生物限度检查法药品灭活方法的探索

贾培建

天津红日药业股份有限公司 天津 301700

2015年中国药典致力于确定四种药物微生物限度的方法，符合欧洲和美国标准。他的标准规定，特别是方法的适用性测试，自2010年版以来发生了重大变化。根据对测试的四个非无菌产品的微生物限量标准（在1105总则，一般原则1106），以确定该产品的微生物限度方法的限制的方法中国药典2015年版已定，而该方法应用到三个产品批次经过测试。结果表明该方法是有效的。并且可能。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DL-CJ-2ND超净工作台(哈东联)；1300SERIESA2生物安全柜(Thermo)；MIR-254型生化培养箱(SANYO)；电热脉动真空灭菌器(山东新华)；PL2002电子天平(梅特勒)；MaxQ6000恒温摇床(Thermo)。

1.2 试药

地拉罗司分散片(国内A厂家，批号：108/109/903；规格：500mg)。

1.3 培养基

从胰脏豆粕液体培养基（批号：151210），胰蛋白酶Sojaagarmedium（TSA，批号：151210），补充有葡萄糖沙氏液体培养基（批号：151210），Sabur葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号）：151210），MacKangkai液体培养基（批号：151210），麦康凯琼脂培养基（批号：151210）购自北京路桥技术有限公司购买；pH为7.0氯化物胨缓冲液：百分之0.9氯化钠（稀释剂，北京路桥科技有限公司，批号141213）注射（4种药物石家庄，批号：1501273201），缓冲液，pH 7的0氯化物蛋白胨（含有百分之3聚山梨酯80和百分之0.3大豆）卵磷脂，批号：151217）。

1.4 菌种

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC(F)98003]、大肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B)44102]均为第3代，均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

在10ml胰蛋白酶大豆根液体培养的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的新鲜培养物接种在33℃24小时，接种白珍珠新鲜的细菌培养在10与葡萄糖液体三郎培养基中在23℃下进行24栽培了几个小时。上述培养物通过的0.9%氯化钠注射稀释，以制备含有1~50 CFU和每1ml细菌的5000至10000 CFU细菌悬浮液。黑曲霉的新鲜培养在23℃下接种的Sabouraud右旋糖琼脂培养基上，培养7天，加入含有0.05%聚山梨醇酯803毫升0.9%氯化钠溶液，孢子被洗脱和菌丝过滤以吸出孢子。将悬浮液置于无菌管中并用含有0.05%聚山梨醇酯和0.9%氯化钠注射液，稀释，以制备每毫升注射液含菌数量可以达到30 CFU到60CFU细菌悬浮液和每毫升注射液含菌数量可以达到3000到6000CFU 的细菌悬浮液。

2.2 计数方法适用性试验

2.2.1 计数培养基适用性检查

取1毫升（30~100 CFU），金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌和黑曲霉，其制备根据在无菌托盘，并倒入TSA培养皿进行观察实验，混合，固化，并在33摄氏度的温度下栽培。金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌培养3天，白色念珠菌和黑曲霉是5天前培养。包括：1毫升（30~100 CFU）从白色念珠菌和黑曲霉中的每个制备的溶液服用，在无菌托盘给予，立即倒入SDA介质，预拌两个板为平行和硬化测试的每种菌株。将细胞培养5天，在23℃，并在该测试培养基用用于上述测试的相应的控制培养基替换同时计数。当平均数目在培养基中的菌落的比例是在0.5~2范围内进行控制介质菌落的平均数，并且符合与对照培养基中的集落的形态，该介质的适用性符合的要求测试。

2.2.2 供试液制备

取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，振摇至供试品分散均匀，制成1:10的供试液，即为供试液A。取本品10g，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，振摇至供试品分散均匀，制成1:10的供试液。取1:10的供试液20mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80mL，即为1:50的供试液，取1:50的供试液10mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90mL，即为1:500的供试液。

2.3 常规法

采用常规平皿法筛查供试品有无抑制微生物生长的作用和抑制的微生物种类。菌液对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入制备好的试验菌液0.1mL（细菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu），混匀，使每1mL稀释液中含菌量为30~100cfu。分别取此菌液1mL注皿，测定其每毫升的活菌数。试验组：取供试液A10mL和制备好的试验菌液0.1mL，混匀，取1mL注皿，测定需氧菌总数。另取供试液A10mL和上述制备好的真菌菌液0.1mL，混匀，取1mL注皿，测定霉菌和酵母菌总数。供试品对照组：取“2.2.2”项下1:10的供试液10mL，加入稀释剂0.1mL，混匀，取1mL注皿，在相应的条件下培养，测定供试品本底的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。

2.4 稀释法和中和法联用

中国药典2015年版规定消除供试品抑菌性的主要方法包括稀释法、中和法、薄膜过滤法以及上述方法的联用。为了便于操作，本试验仅改进了供试液的制备，选择了稀释法和中和法联用，即将中和剂聚山梨酯80和大豆卵磷脂添加到稀释液中，结合供试品的微生物限度标准，将供试品稀释为1:50和1:500。试验组：取1:500的供试液10mL和制备好的试验菌液0.1mL，混匀，取1mL注皿，测定需氧菌总数。另取1:50供试液10mL和上述制备好的真菌菌液0.1mL，混匀，取1mL注皿，测定霉菌和酵母菌总数。供试品对照组：取“2.2.2”项下1:500和1:50的供试液10mL，加入稀释剂0.1mL，混匀，取1mL注皿，在相应的条件下培养，测定供试品本底的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。稀释剂对照组：取含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入制备好的试验菌液0.1mL(细菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu)，混匀，使每1mL稀释液中含菌量30~100cfu。分别取此菌液1mL注皿，测定其每毫升的活菌数[1]。

3 讨论

微生物限度检查方法学适用性试验时采取常规平皿法，发现该药品对微生物有较强的抑制作用，按照中国药典2015年版的要求尝试了几种方法消除抑菌性，结合固体口服制剂的限度标准，如果仅采用稀释法，抑菌性不能消除，因此本实验结合使用了中和法。根据文献报道，地拉罗司别称4-3,5-二(2-羟基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸，由于化学结构的特性，决定其具有抑菌性。由于苯甲酸本身主要用于抗真菌及消毒防腐，在进行计数方法适用性试验时，采用常规方法和常规的稀释剂(pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液)无法去除抑菌作用，因此，考虑使用稀释法和中和剂(3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液)联用的方法进行计数方法适用性试验，结果各试验菌株回收率比值达到药典要求的0.5~2.0之间。

考虑到平皿法比薄膜过滤法操作方便、简捷，因此本试验菌落计数方法采用稀释法和中和法联用，控制菌检查采用稀释的方法进行。本研究可为不同来源的地拉罗同类产品微生物限度检查提供参考。