太白楤木总皂苷对肝纤维化小鼠氧化应激水平的影响及机制

黄攀，潘晓霞，李涛，范妤

(陕西中医药大学，陕西咸阳712046)

肝纤维化是慢性肝损伤的特征，其发生是多种细胞、细胞因子以及信号传导通路之间相互作用的结果，氧化应激在肝纤维化的发生和进展中起关键作用[1]。楤木产自秦岭及大巴山区，其根皮可入药，具有祛风除湿、活血散瘀、消肿止痛、健脾利水的功效，临床常用于治疗风湿性关节炎、急慢性肝炎、跌打损伤、骨折和糖尿病。太白楤木为楤木属的一种，其根皮中含有丰富的太白楤木总皂苷(TSAT)。研究显示，TSAT具有良好的保肝活性和抗纤维化作用[2，3]，但其具体作用机制尚不清楚。Keap1-Nrf2-ARE通路是体内最重要的抗氧化应激通路之一，核因子E2相关因子2(Nrf2)是该通路中的关键酶，而血红素加氧酶-1(HO-1)是其下游抗氧化酶之一。2018年7～12月，我们采用CCl4制作肝纤维化小鼠模型，观察TSAT对小鼠氧化应激水平的影响，并探讨其与Keapl-Nrf2-ARE信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与药品 清洁级健康雄性昆明小鼠40只，体质量(20±3)g，购于成都达硕实验动物有限公司。小鼠分笼饲养，室温保持(25±3)℃，自由进水，普通饲料喂养，适应性饲养1周后用于实验。TSAT溶液由陕西中医药大学中药制剂设计研究室提供，用蒸馏水配制成200、400 mg/kg的TSAT混悬液，4 ℃保存备用。

1.1.2 试剂与仪器 羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Masson三色染色液试剂盒购自北京索莱宝公司；DAB显色试剂盒、兔抗Nrf2、购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗HO-1、SABC免疫组化试剂盒、BCA蛋白定量测试盒均购自武汉博士德，DM4000B生物显微镜(德国LEICA公司)，Bio-Tek ELX808IU酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组造模与药物干预 将40只小鼠随机分成对照组、模型组、TSAT高剂量组和TSAT低剂量组，每组各10只。模型组及TSAT高、低剂量组给予腹腔注射0.15 mL/kg(按10%溶于橄榄油中)的CCl4溶液，对照组腹腔注射等量橄榄油，2次/周，连续8周。造模同时，TSAT高、低剂量组分别给予400、200 mg/kg TSAT混悬液灌胃，其他两组灌注等量生理盐水，1次/d，持续8周。8周后将小鼠注射10%水合氯醛麻醉，取肝脏组织，将肝大叶用4%多聚甲醛固定用于病理切片，剩余肝脏组织置于-80 ℃保存，用于制备肝组织匀浆和提取肝组织蛋白。

1.2.2 肝组织形态学及胶原纤维沉积情况观察 取肝大叶组织，石蜡包埋，切成4 μm厚切片。行HE染色，显微镜下观察组织形态学变化；行肝组织Masson染色，严格按照试剂盒步骤操作，显微镜下观察胶原纤维的沉积情况。

1.2.3 肝组织氧化应激指标检测 取肝右叶剪碎，加入裂解液再匀浆，离心取上清液。使用碱水解法检测HYP含量，TBA法检测MDA含量，WST-1法检测SOD活性。严格按照说明书步骤操作。

1.2.4 Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关因子Nrf2、HO-1蛋白表达检测 采用免疫组化SABC法。肝组织切片常规脱蜡、水化，放入枸橼酸盐缓冲液中加热，用油笔画圈后滴加5% BSA封闭液，一抗、二抗孵育，滴加试剂SABC，再DAB显色、复染，最后脱水、透明，中性树胶封片，光镜(×200)下观察。每张切片随机取5个不重叠视野拍照，Image-Pro软件处理图像，分析光密度(OD)值。

2 结果

2.1 各组肝组织形态学比较 HE染色显示，对照组肝脏组织形态正常，肝小叶结构清晰完整，肝细胞排列整齐，未发现炎症细胞浸润；模型组肝细胞结构遭到严重破坏，排列不规则，有炎症细胞浸润和大量脂肪空泡，形成假小叶，出现大量肝细胞变性或坏死，而且形成胶原纤维增生；TSAT高、低剂量组与模型组比较，肝组织结构破坏程度缓解，炎症细胞浸润减少，TSAT高剂量组较低剂量组改善更加明显。

2.2 各组肝组织胶原纤维沉积情况比较 Masson染色显示，对照组肝板排列整齐，无胶原纤维增生；模型组形成大量蓝色胶原沉积，在肝小叶中央和汇管区出现胶原纤维束；TSAT高、低剂量组与模型组比较，肝组织结构损伤得到不同程度的缓解，蓝色胶原沉积明显减少，TSAT高剂量组较低剂量组胶原纤维沉积显著减少。

2.3 各组肝组织HYP、MDA含量及SOD活性比较 与对照组比较，模型组HYP、MDA含量升高，SOD活性降低(P均<0.01)；与模型组比较，TSAT高、低剂量组HYP、MDA水平均下降，SOD活性均升高(P均<0.01)，且TSAT高剂量组HYP、MDA水平低于低剂量组，SOD活性高于低剂量组(P均<0.05)。见表1。

2.4 各组肝组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较 与对照组比较，模型组Nrf2、HO-1蛋白表达下降(P均<0.01)；与模型组比较，TSAT高、低剂量组Nrf2、HO-1蛋白表达均上升(P均<0.01)，TSAT高剂量组Nrf2、HO-1蛋白表达高于低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表1 各组肝组织HYP、MDA含量及SOD活性比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与TSAT低剂量组比较，&P<0.05，&&P<0.01。

表2 各组肝组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与TSAT低剂量组比较，&P<0.05。

3 讨论

肝纤维化是由慢性肝损伤导致的病理改变，其特征是细胞外基质(ECM)的过度沉积和瘢痕形成，进一步发展为肝硬化，甚至引起肝癌。研究显示，当肝损伤的因素被去除后，纤维化过程是可逆的;但是，针对病毒感染等病因的治疗效果并不理想，而且目前尚无特异性治疗肝纤维化的药物。因此，肝纤维化的发生机制及关键靶点仍需深入研究。许多中药及其提取物的有效成分具有良好的抗纤维化作用，而且中药具有不良反应小、多靶点等优势。太白楤木根皮是治疗肝炎的民间药物，TSAT是其有效成分。胡文军等[4]报道，TSAT可降低血清GPT、GOP活力，从而减轻由CCl4诱导的小鼠急性肝损伤。崔大江等[5]发现，TSAT能降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1水平，并抑制Smads4基因表达，从而减弱TGF-β1-Smad信号通路介导的肝损伤和胶原产生。

ECM的重要功能是维持组织稳态和形成纤维支架。在慢性肝损伤时，ECM增生与降解失衡，进而导致肝脏内胶原纤维异常沉积并形成瘢痕组织，从而引起肝纤维化。所以,减少ECM过度沉积是治疗肝纤维化的主要策略。黄苗等[6]报道，太白楤木可降低肝纤维化大鼠肝脏中Ⅰ型胶原纤维、Ⅲ型胶原纤维的表达，从而抑制胶原纤维增生。本实验结果显示，与对照组比较，模型组有炎症细胞浸润，大量肝细胞变性或坏死和蓝色胶原沉积，表明小鼠肝纤维化模型制作成功，肝脏内出现明显的炎症、肝细胞损伤和胶原纤维增生。与模型组比较，TSAT高、低剂量组肝细胞破坏程度明显减轻，炎症细胞浸润和蓝色胶原沉积减少，高剂量组较低剂量组改善更加明显。表明肝纤维化小鼠经TSAT治疗后，肝细胞形态得到修复，肝纤维化症状明显减轻，并且能够有效抑制肝组织中胶原的分泌和沉积，从而减轻肝损伤和胶原纤维增生，表明TSAT具有抗纤维化作用。

研究显示，氧化应激参与了肝纤维化的发生发展[7]。在氧化应激过程中，过度积累的活性氧(ROS)会破坏大分子，增加脂质过氧化，诱导肝细胞坏死和凋亡，并且直接激活HSC和刺激促纤维因子的产生。因此，靶向氧化应激损伤将有助于肝纤维化的治疗。HYP能够反映肝组织中总胶原蛋白的水平，可作为纤维化的标志物[8]。MDA是脂质过氧化醛类最终产物之一，其升高程度可反映肝组织中脂质过氧化损伤的程度[9]。SOD是一种重要的抗氧化酶，其作用是清除氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，其活性可反映肝脏清除氧自由基和抗氧化的能力[10]。Xi等[11]报道，TSAT在体外可以有效清除自由基，并且能够抑制大鼠肝微粒体的脂质过氧化，证明TSAT具有抗氧化活性。本实验结果显示，与对照组相比，模型组HYP、MDA水平升高而SOD活性下降，说明小鼠肝组织纤维化程度加重，脂质过氧化水平增加。经TSAT治疗后，肝纤维化小鼠肝脏内HYP、MDA水平下降而SOD活性增强，证实TSAT具有显著的抗氧化活性，并降低肝脏内胶原纤维增生和氧化应激水平。

Keap1-Nrf2-ARE通路是内源性抗氧化应激通路之一，其中Nrf2是抗氧化损伤的关键调节因子。氧化应激时Nrf2与Keap1解离，然后激活ARE并抑制其下游抗氧化酶(如GSH、HO-1)的表达。Nrf2可以调节各种抗氧化剂和解毒酶表达，其在抗氧化损伤中起重要作用，因此通过激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路将有助于减轻肝纤维化。李成全等[12]发现，在用H2O2诱导小鼠胚胎成纤维细胞OS模型中，太白楤木竹节参皂苷Ⅳa(CHS)以剂量依赖性方式降低细胞总ROS和线粒体ROS水平，并抑制抗氧化应激Nrf2通路Nrf2、HO-1、GCLC和GCLM相关蛋白表达，说明CHS具有显著的抗氧化作用。郭育等[13]报道，TSAT可显著抑制tBHP导致的细胞ROS水平升高，并引起Nrf2及其下游的HO-1、GCLC、GCLM表达增加。本实验结果显示，与对照组比较，模型组Nrf2、HO-1蛋白表达降低，说明由CCl4引起的肝损伤抑制了Keap1-Nrf2-ARE抗氧化途径相关蛋白的表达，使肝脏抗氧化损伤能力降低，肝纤维化小鼠经TSAT治疗后，Keap1-Nrf2-ARE通路相关因子Nrf2、HO-1蛋白表达升高，表明TSAT通过激活Keap1-Nrf2-ARE途径，增加其下游靶蛋白HO-1的表达，从而减轻由ROS引起的肝损伤和肝纤维化。

综上所述，TSAT能够通过抑制氧化应激水平而减少小鼠肝组织中胶原的合成分泌，从而抑制肝纤维化,其抗氧化应激作用机制可能与上调肝组织Keap1-Nrf2-ARE信号通路中Nrf2表达和激活其下游抗氧化酶HO-1相关。