从内皮化进程评价LAMaxTM 左心耳封堵器的有效性

吴晓霞，马东星，孟越之，黄伟，陈奕龙，沈叶佳

心房颤动（房颤）是临床常见的心律失常，其主要危害之一是动脉系统的血栓栓塞。90%非瓣膜性房颤患者的血栓来源于左心耳（LAA）。经皮左心耳封堵术可作为卒中高危和有长期口服抗凝治疗禁忌证患者的治疗选择，被写入了欧洲心脏病学会（ESC）房颤治疗指南。针对经皮左心耳封堵器械WATCHMAN（波士顿科学，美国）的循征医学试验PROTECT AF、PREVAIL、ASAP、EWOLUTION 研究等证实了WATCHMAN 的临床上的安全性及有效性[1-4]。

本研究应用国产新型LAMaxTM左心耳封堵器对实验犬进行左心耳封堵术，并对术后1 个月、2 个月、3 个月、6 个月不同时间节点的犬进行解剖观察，旨在观察术后不同时间封堵器表面心内膜覆盖情况，评估封堵盘心房侧内皮化进程，从解剖学角度评价左心耳封堵的有效性。

1 材料与方法

实验动物：2015 年8 月至2017 年1 月，健康犬30 只，雌性7 只，雄性23 只，体重24.5～36.0 kg，平均（27.8±3.7）kg，由北京市平谷区实验动物中心提供，动物实验方案经北京平谷模拟医院伦理委员会批准，心电图示30 只犬均为窦性心律。

左心耳封堵术：实验犬于术前12 h开始禁食，术前30 min 以盐酸赛拉嗪注射液0.1 mg/kg 肌肉注射麻醉后仰卧固定于手术台上，剃净双侧腹股沟区及四肢体毛，行心电监护、气管插管并连接呼吸机机械通气，于左后肢建立静脉通道，以丙泊酚注射液静脉滴注维持麻醉。经右侧股静脉途径行房间隔穿刺（圣犹达医疗，美国），送入猪尾导管（泰尔茂，日本）行左心耳造影，测量左心耳开口直径、深度及LAMaxTM左心耳封堵器（深圳市科奕顿生物医疗科技有限公司，中国）工作轴线，选择LAMaxTM型号及类型，将封堵器固定于推送杆头端，由左心耳封堵器输送鞘管（深圳市科奕顿生物医疗科技有限公司，中国）将封堵器调整至目标叶内，依次打开锚定盘及封堵盘，行牵拉试验确定是否固定牢固，行左心耳造影及经食管超声心动图（TEE），如符合“COVER”原则，释放封堵器[5]。

TEE 检查：超声诊断仪：GE 公司Vivid E9 X Dclear 彩色多普勒超声诊断仪，6VT 经食管探头，频率为2～7 MHz。通过撑口器将探头置入食管内50～60 cm，分别从0°、45°～60°、80°～90°、120°～135°等不同角度显示左心耳形态、分叶。测量左心耳开口最大径、深度以及二尖瓣环至左上肺静脉开口距离（MA-PV）等参数[6-7]，彩色多普勒显像显示肺静脉及二尖瓣过瓣血流；术后观察封堵器形态、位置及与周边组织关系，图像采集为3～5 个心动周期图像。

术后随访及解剖：按照随机分组：即刻组7 只、1 个月组6 只、2 个月组5 只、3 个月组7 只、6 个月组5 只，按照时间表进行TEE 复查，按照分组进行实验犬过量麻醉剂处死。处死后，行大体解剖检查。剖开胸腔，分离心脏周边组织及血管，完整取出心脏，观察心包腔内是否有积液，并进行肺脏、肝脏、脾脏等其他脏器的大体解剖标本观察。从右心房壁剪开心脏标本，观察房间隔穿刺点位置，随后剪开房间隔进入左心房，观察封堵伞位置、形态、封堵盘表面情况、封堵盘与周围组织关系等；再从左心耳顶部剪开左心耳壁观察锚定盘固定情况。切除包含完整封堵器的左心耳组织，用10%甲醛溶液固定，包埋（光聚树脂），以备切片。切片（EXAKT300CP 硬组织切片机、金刚石切割带）、磨片（EXAKT400CS 硬组织磨片机），切片厚度为100～120 μM，HE 染色后光学显微镜下观察封堵盘表面内皮化及其它情况。

统计学处理：采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，正态分布方差齐者两两比较采用配对t检验，方差不齐两个独立样本间采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TEE 测量左心耳相关数据

30 只犬TEE 测量左心耳开口为（16.6±2.8）mm，深度为（24.0±4.1）mm，二尖瓣环至左上肺静脉开口距离为（25.9±2.9）mm。封堵盘实际型号直径（25.7±2.4）mm，术后TEE 测量封堵盘直径（23.7±2.6）mm，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 左心耳封堵术后TEE 复查

术后即刻TEE 检查：二维图像显示30 只犬的封堵器形态良好，5 只发现残余分流（1 只分流束宽度约5 mm，其余4 只均＜3 mm）；3 只发现少量心包积液（1 只为即刻组，复查后处死）；4 只封堵盘对二尖瓣环有压迫，其中1 只压迫二尖瓣环的同时亦遮挡左上肺静脉开口。

术后1 个月时，复查1 个月组、2 个月组、3个月组、6 个月组共23 只，TEE 显示封堵器均覆盖于左心耳开口，表面均未见血栓，4 只犬封堵盘压迫二尖瓣环，其中2 只复查TEE 可见封堵盘对二尖瓣环的压迫减轻，未对二尖瓣后叶运动造成影响。2只术后即刻发现心包积液的犬在1 个月复查时心包积液消失。

彩色多普勒血流显像（CDFI）显示残余分流的5只犬中，1 只为1 个月组，1 只为2 个月组，3 只为3 个月组。1 个月TEE 复查时，1 个月组和2 个月组的2 只残余分流消失，3 个月组3 只均仍可见残余分流。2 个月复查时3 个月组中的1 只残余分流消失，另2 只在3 个月复查时仍可见残余分流。

2.3 解剖标本观察

对实验犬大体解剖标本观察，未见肝、脾、肾等主要器官的梗死病灶。

2.3.1 封堵盘形态对愈合反应的影响

封堵盘完全拉入左心耳开口呈新月型者，其愈合反应较快，在1 个月时心内膜即可完全覆盖封堵盘心房面，有的甚至完全覆盖中央螺栓；但心内膜是否中央螺栓完全覆盖因个体差异而变化较大、反应不一，有至3 个月还尚未完全覆盖。

封堵盘未完全拉入左心耳开口的封堵盘表面愈合反应差异显著：1 个月组1 只封堵盘心房面被覆厚实新生内皮，但接近二尖瓣环约60°区域尚未完全被新生组织覆盖（图1）；3 个月复查时仍有残余分流的犬解剖可见封堵盘心房面已完全内皮化，左上180°与周围心房壁已经紧密结合，右下180°左右范围未与心房壁融合，掀起可见未完全封堵，仍有一缝隙与左心房交通（图2）。

图1 1 个月组犬解剖图，封堵盘心房面已完全内皮化,但接近二尖瓣环约60°区域尚未完全被新生组织覆盖

图2 CDFI 示术后3 个月仍可见残余分流的1 只犬解剖结果

2.3.2 残余分流者愈合反应

TEE 示小叶未封堵并有残余分流的3 个月组中的2 只犬，解剖可见1 只犬封堵盘一侧边缘陷入左心耳开口者，未及肺静脉开口及二尖瓣环，封堵盘表面内皮化完全，无血栓附着。另1 只封堵盘表面覆盖组织、光滑,表面内皮化完整，但封堵盘边缘陷入左心耳处可见一细小缝隙，可以通过18 号针头。

2.3.3 锚定盘的愈合反应

2 只TEE 显示封堵盘悬空于左心房内，未与左心耳开口完全贴合者，锚定盘封堵于左心耳颈部。锚定盘亦可通过新生组织与心房结合紧密，1 个月时封堵盘表面有较薄内皮覆盖，中央螺栓裸露。3个月时锚定盘位于左心耳开口完全内皮化，封堵盘表面亦完全内皮化，两者中部的连接杆上亦完全附着新生组织。

2.3.4 经皮左心耳封堵术后6 个月愈合反应

6 个月组5 只犬封堵盘表面已完全内皮化，其中2 只（21#，8#）封堵盘未拉入左心耳内者封堵盘表面及背面均已内皮化；8#封堵盘边缘压迫二尖瓣环及部分遮挡肺静脉开口者，封堵盘表面内皮化并与肺静脉开口及二尖瓣环摩擦处形成类似新生肉芽组织；21#封堵盘下缘超过二尖瓣环约3 mm，与二尖瓣环磨擦部位见类似新生肉芽组织。

2.3.5 锚定盘固定情况

30 只犬的LAMaxTM锚定盘均固定于左心耳内壁，未见穿出，即刻组可见锚定盘固定区局部有水肿，1 个月以上各组左心耳壁组织水肿消失。锚定盘与封堵盘之间连接杆固定良好，未见断裂分离。因锚定区与封堵盘间距离较短，解剖可见完全封堵后锚定盘后部的左心耳腔因无血流进，左心耳前后壁的完全黏连完全封闭左心耳腔，但有残余分流者左心耳前后壁不能完全黏连。

2.3.6 组织切片观察

在1 个月、2 个月、3 个月、6 个月的LAMaxTM封堵盘左心房侧的病理切片中可见封堵盘心房侧均可见新生内膜覆盖，新生内膜从封堵盘延续至左心房表面，并与之黏连，显示其愈合反应良好，如大体标本所见一致。锚定盘固定位置未见组织坏死（图3）。

图3 组织切片(沿着左心耳和封堵器中心矢状切面)可见封堵盘心房侧均可见新生内膜覆盖,锚定盘固定位置未见组织坏死

3 讨论

随着经皮左心耳封堵术在临床的逐步开展，针对左心耳的不同形态也涌现出不同设计的左心耳闭合器械。形似“瓶塞式”设计的WATCHMAN 以及AMPLATZER ACP（圣犹达医疗，美国）、LAmbre（先健科技，中国）类似“瓶盖式”左心耳封堵器。本研究采用“瓶盖式”设计的LAMaxTM封堵器，为双盘状结构，由封堵盘、锚定盘及一腰部连接杆组成，封堵盘与锚定盘之间距离为10 mm。封堵盘由镍钛丝编织盘及被覆其上的阻流膜组成，该阻流膜心房面经过嫁接负电荷，使得表面负离子化，降低封堵盘心房面表面的血小板黏附，同时提升阻流膜的亲水性和生物相容性，降低器械相关性血栓形成的风险。锚定盘包括阻流膜及九根交错排布的固定倒钩，形成盘状结构[5]。

继Reddy 等[2]研究得出WATCHMAN 装置封闭左心耳不劣于长期华法林治疗后，Holmes 等[3]研究中证实了早期的安全事件2.2%，显著低于PROTECT AF，如需要心包穿刺引流的心包积液发生率从PROTECT AF 研究的2.9% 降至1.5%。PROTECT AF、PREVAIL 研究要求术后服用华法林和阿司匹林45 天，随后停用华法林，改为氯吡格雷+阿司匹林双联抗血小板治疗至术后6 个月。2017 年发表的Boersma 等[4]研究1 年的结果显示：WATCHMAN 封堵器置入成功率提高，达98.5%；1年WATCHMAN 组缺血性卒中发生率为1.1%，大出血发生率2.6%，证实了其临床上的有效性和安全性。EWOLUTION 研究中术后服用新型口服抗凝药或维生素K 拮抗剂的比例为27%，应用双联抗血小板治疗者达60%，未用抗凝药的患者占6%。

器械相关性血栓多见于封堵器置入后最初的几周，封堵盘表面未完全内皮化，其诊断依赖于TEE影像[8]。同时，器械相关性血栓亦可由继发性原因（未完全封堵、左心耳残余分流等）及患者的全身系统性原因引起。一项纳入2008～2015 年30 项研究的荟萃分析显示：2 118 例左心耳封堵术中出现82 例发生器械相关性血栓，发生率约3.9%，WATCHMAN 约3.4%，AMPLATZER ACP/Amulet 约4.6%[9]。

为了提供关于封堵器与组织接触面愈合情况的组织病理学证据，Schwartz 等[10]应用9 条犬，分别观察了术后3 天、45 天、90 天WATCHMAN 表面内皮化进程，证实术后45 天即可见心内膜完全覆盖了封堵器心房面并延续至左心房表面，对封堵器心房面进行了有效隔离，早期的纤维素沉积被心内膜取代，心内膜组织包括包裹在封堵盘的金属及编织物中的蛋白聚糖-胶原基质及平滑肌细胞。通过与人类标本对比指出：动物与人类的愈合反应相似，但动物的反应较快一些。Tang 等[11]观察了6 只实验犬置入LACBES®occluders 后封堵盘表面内皮化情况，用电镜扫描观察到左心耳封堵术术后80 天及110 天内皮细胞及基质的附着。

本研究应用LAMaxTM进行左心耳封堵术，通过对左心耳封堵术后不同时间节点的大体标本及病理组织切片的观察，观察了封堵器的形态、位置、塑形及对周边组织的影响等，通过解剖证实封堵器置入良好，与周围组织相容性较好，未见磨损二尖瓣环、肺静脉壁及左心耳壁等情况发生，封堵盘表面新生组织完整，随着置入时间的增加可以完全阻隔左心耳与左心房之间的血流交通，提示LAMaxTM的有效性。至术后6 个月TEE 复查未见器械相关性血栓发生，术后随访观察及解剖均未见相关栓塞证据，提示LAMaxTM的安全性。

通过对左心耳封堵术后随访、解剖观察可见本研究组提出的COVER 原则[5]对于此类“瓶盖式”封堵器的重要意义，特别是“C”：Concavity 即封堵器是否拉入左心耳开口并呈新月型，将直接影响到封堵盘表面内皮化的进程，封堵盘按照COVER 原则完全封堵盘拉入左心耳开口呈新月型者，其愈合反应较快，在1 个月时即可以完全覆盖封堵盘表面，甚至完全覆盖中央螺栓，内皮化较快且完整；但封堵盘未完全拉入左心耳开口的封堵盘表面愈合反应差异较大，并与封堵盘的形态、是否陷入左心耳开口相关，本研究中观察到愈合反应可以通过封堵盘与其接触的位置反复摩擦形成肉芽组织完成其愈合过程；而封堵盘悬于左心房未覆盖开口者，随着时间的推移，锚定盘位于左心耳开口完全内皮化，封堵盘表面及中部的连接杆上亦完全附着新生组织，从而阻断左心房与左心耳之间的血流交通。因此，本研究提示经皮左心耳封堵术操作的术者尽力将“瓶盖式”封堵器的封堵盘拉入左心耳开口以缩短封堵盘表面内皮化时间，必要时可以更换封堵器置入的小叶或封堵器型号，力求完美，进而加速封堵盘表面内皮化进程。由此提示：封堵盘是否完全拉入左心耳开口将影响封堵盘左心房侧的内皮化进程，进而影响临床患者抗凝治疗的时间。

左心耳一般为狭长、弯曲的管状盲腔，分成开口、颈部和分叶3 个部，分叶部即为基底部，其腔内有丰富的梳状肌。LAMaxTM的封堵盘与锚定盘之间距离为10 mm，封堵盘固定在左心耳开口部，锚定盘通常固定于左心耳的颈部，从解剖标本观察锚定盘后部的左心耳分叶部因完全封堵无血流进入，左心耳前后壁可以完全黏连，进而达到了完全封闭左心耳腔的效果，但有残余分流者左心耳前后壁不能完全黏连，未完全阻隔左心房与左心耳之间的血流交通。而WATCHMAN 的直径与长度呈正比，且其尾部撑开左心耳前后壁，无法完全闭塞左心耳腔，其封堵效果依靠封堵器表面的内皮化达到，这也是这两类不同类型封堵器的区别。

本研究应用“瓶盖式”设计的LAMaxTM左心耳封堵器对实验犬进行左心耳封堵术，并对术后1 个月、2 个月、3 个月、6 个月的犬进行解剖标本观察，显示符合COVER 原则，即封堵盘完全拉入左心耳开口者术后1 个月新生内膜可完全覆盖封堵盘表面，而有残余分流者即使彩色多普勒血流分流束宽度＜5 mm，至3 个月封堵盘边缘仍可见一细小缝隙与左心房相通。术后6 个月时封堵盘表面已完全内皮化，被厚实的新生组织所覆盖，包括中心螺母的部位，即使封堵盘未拉入左心耳内者封堵盘表面及背面均已内皮化达到完全封堵左心耳的效果。从解剖学角度证实了LAMaxTM左心耳封堵器进行左心耳封堵术的有效性。

本研究应用的是正常窦性心律的实验犬，非房颤模型，故无心功能不全及左心房明显扩大的房颤心律实验犬，是本研究结论的局限性。