N-乙酰转移酶8在人肾透明细胞癌中的表达及临床意义

肾癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，起源于肾实质小管上皮系统，约占人类全部恶性肿瘤的2%～3%，通常又被称为肾细胞癌[1，2]。RCC约占肾脏肿瘤的90%，其病理类型有多种，其中80%为肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，CCRCC）[3]。RCC 的发生发展是多步骤、多基因共同作用的过程，其发病风险与个体对内、外源性有害物质代谢解毒活性的遗传变异有关，人体摄入大多数外源性致癌物后，需经过体内代谢激活才能损伤DNA，引起基因突变从而导致细胞癌变[4]。N-乙酰转移酶（N acetyltransferases，NAT）是人体内重要的致癌物灭活酶，其中NAT8（N-乙酰转移酶8）是蛋白质编码基因，为NAT家族重要成员之一，作为一种微粒体酶，仅在人的肾脏和肝脏中表达，被认为在肾脏和肝脏结构及功能的发育和维持中发挥重要作用[5]。NAT8可以乙酰化半胱氨酸S-缀合物的游离α-氨基形成硫酸，还可以通过乙酰化和调节PROM1的表达来调节凋亡[6，7]。2011年1月～2014年12月和 2016年9月～2017年2月我们分别检测42例CCRCC患者肿瘤及瘤旁组织中NAT8蛋白的含量以及12例CCRCC患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织中NAT8 mRNA含量，分析NAT8与CCRCC病理分期、肿瘤分级以及患者临床特征的关系，探讨NAT8与CCRCC发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 qRT-PCR实验组 12例患者术后病理均证实为CCRCC。5例行肾癌根治术，7例行保留肾单位肾肿瘤切除术；男7例，女5例；右肾肿瘤8例，左肾肿瘤 4例；年龄 18～80岁，平均（55.3±9.5）岁；肿瘤直径大小 1.0～10.0cm，平均（5.0±2.1）cm；高分化1例，中分化10例，低分化1例；T1期11例，T2期1例。

1.1.2 免疫组化实验组 42例患者术后病理均证实为CCRCC。42例均行肾癌根治术；男22例，女20例；年龄18～80岁，平均（53.7±10.4）岁，其中≤54岁者22例，＞54岁者20例；肿瘤直径大小2.0～10.0cm，平均（5.8±1.9）cm，其中≤7cm 31例，＞7cm 11例；TNM 分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期11例，无Ⅲ及Ⅳ期患者；参照Fuhrman分级[1]：高分化25例，中分化17例，无低分化患者。

1.2 试验方法

1.2.1 qRT-PCR实验组 取组织样本75mg，Trizol法提取RNA，使用微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Random primer扩 增 RNA，NAT8引 物 设 计 为 F：5'-CAAGCCCCAGACGGTATCTC-3'；R：5'-TCCT GGTATTTGCGGATGTGA-3'，产物长度 190bp。内参β-actin（Human）引物设计为F：5'-AGCACAGAG CCTCGCCTTTG-3'，R：5'-CTTCTGACCCATG CCCACCA-3'，扩增产物长度208bp。荧光PCR扩增，依次按照 95℃ 10s、60℃ 60s、95℃ 15s顺序，并从60℃缓慢加热到99℃（+0.05℃/s，期间收集荧光），以此建立PCR产物的溶解曲线。各样品的目的基因和内参基因分别进行Realtime PCR反应，采用ΔΔCт的相对定量：仪器直接生成各样品目的基因和内参基因的Cт值。将每个样品的目的基因浓度除以其内参基因的浓度，所得出的数值即为此样品此基因校正后相对含量。

1.2.2 免疫组化实验组 免疫组化染色法测定42例CCRCC肿瘤及瘤旁组织标本NAT8蛋白，收集肿瘤及癌旁组织（癌旁组织为距离肿瘤1cm以上的肾组织），手术切除标本后立即置入40%甲醛溶液中固定48～72h。参照MaxVisionTM/HRP即用型试剂盒操作说明书进行免疫组化染色，包括脱蜡、水化，抗原修复，加一抗（兔抗人 NAT8多克隆抗体，购自Abcam公司），加二抗（即用型MaxVisionTM /HRP免疫组化试剂盒，购于福州迈新生物技术开发有限公司），显色，复染，脱水、封片。采用免疫组织化学Volm判断标准，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。阴性和弱阳性视为低表达状态，阳性和强阳性视为高表达状态。所有标本的IHC切片交由两位病理专家独自审阅，分别给出各自结论，当两位专家意见无法统一时，再请第三位病理学专家独立给予判别。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以例比较，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR实验组12例CCRCC患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织行qRT-PCR检测，结果显示CCRCC组织中NAT8 mRNA的相对表达量明显低于癌旁正常肾组织，差异有统计学意义（P=0.003），见图1。

图1 qRT-PCR检测CCRCC与癌旁组织NAT8mRNA表达水平

2.2 免疫组化实验组IHC染色结果显示，42例患者肿瘤及癌旁正常组织标本中NAT8均有不同程度的表达（见图2），NAT8蛋白在肾癌中呈低表达，癌旁正常肾组织中高表达，肾癌及癌旁组织中低表达率分别为 60%（25/42）、12%（5/42），差异具有统计学意义（χ2=20.741，P<0.001）。

图2 免疫组化检测CCRCC组织中NAT8表达水平

42例CCRCC患者中，不同年龄、性别患者癌组织中NAT8表达差异无统计学意义（P=0.952、P=0.187）；不同肿瘤直径、肿瘤分期及分级患者癌组织中NAT8表达差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

42例CCRCC患者中，随访25例，失访17例。随访12个月结果：无死亡患者，1例带瘤生存，为低表达；24例无瘤生存，分别为9例高表达、15例低表达；随访24个月结果：1例死亡，为低表达；6例带瘤生存，2例为高表达，4例低表达；18例无瘤生存，分别为7例高表达、11例低表达；随访36个月结果：2例死亡，均为低表达，8例带瘤生存，3例为高表达，5例为低表达；15例无瘤生存，分别为6例高表达、9例低表达。死亡患者均为肿瘤组织NAT8低表达患者，肿瘤组织NAT8高表达CCRCC患者随访3年无一例死亡。

表1 NAT8表达与CCRCC患者临床特征的关系[n（%）]

3 讨论

肾癌是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康。据统计，美国2016年新诊断肾癌患者62 700例，因肾癌死亡者 14 020例，诊断时中位年龄为64岁[8]。我国肾癌的发病年龄亦渐趋于年轻，发病率呈逐年增长趋势，每年确诊为肾癌患者的比例约为男性37/10万人群、女性16/10万人群。常见恶性肿瘤中，近20年来肾癌的发病率上升速度最快[9]，由于RCC临床症状多变，目前对其早期诊断较为困难，尚无特异性方法，约1/4～1/3的患者入院诊断时已为中晚期；同时，由于肾癌对放射治疗及化学治疗均不敏感，根治性手术切除为早期肾癌患者的主要治疗方式，然而术后复发率仍然可能高达20%[10]。因此，临床上对不同肾癌患者预后的合理预测将有助于改善其治疗效果。

目前，肾癌的组织学类型主要有10个，包括透明肾细胞癌、多房囊性透明肾细胞癌、乳头状肾细胞癌Ⅰ型和Ⅱ型、嫌色肾细胞癌、Bellini集合管癌、肾髓样癌、Xp11易位性肾癌、神经母细胞瘤伴发癌、黏液性管状及梭形细胞癌及尚未分类的肾细胞癌[3]。其中最常见的组织学类型是透明肾细胞癌，占肾癌总数的70%～90%[11]。手术为早期CCRCC有效的治疗方法，然而术后一旦发生肿瘤复发转移，预后较差。目前临床上将癌肿的直径大小、组织学类型、Fuhrman分级、肿瘤分期、肿瘤坏死、淋巴结转移及微血管浸润等用来预测肾癌术后的预后情况，然而临床报道差异较大，且尚无理想的单一临床因素可以预测肾癌患者的预后。

近年来，随着分子生物学的快速发展，人们发现越来越多的蛋白标记物与CCRCC发生及发展有关。它们的发现不仅有助于评估CCRCC患者的预后，同时也有助于临床医生明确 RCC患者的诊断、预判其术后局部复发或远处转移，并可能成为新的靶点，用于分子靶向药物的研发及CCRCC患者的治疗[12]。NAT8为N-乙酰转移酶家族成员之一，其功能是催化乙酰基团从乙酰辅酶A（CoA）到芳香胺和酰腙等杂环胺类物质，在某些药物代谢、致癌物质灭活或活化过程中都起着重要的作用。NAT8在正常的肝及肾组织中高表达[13]。Zand等[14]研究发现卵巢癌中NAT8及其代谢产物N-乙酰天冬氨酸（NAA）表达水平与患者总体生存期具有相关性，且靶向干扰NAT8可下调FOXM1、降低肿瘤细胞活力。Lou等[15]在非小细胞型肺癌（NSCLC）中发现，通过siRNA下调NAT8可抑制NSCLC细胞的NAA产生，提示NAT8在非小细胞肺癌中的作用可能与其代谢物NAA密切相关。然而，目前NAT8在肾癌方面的研究报道较少。在本研究中，我们检测了NAT8在CCRCC组织及癌旁正常肾组织中的表达。采用免疫组化法检测42例CCRCC肿瘤组织及癌旁正常肾组织中NAT8的表达，结果显示在正常肾组织及CCRCC组织中均可见阳性表达。然而，在正常肾组织中，NAT8以高表达为主，而CCRCC组织中NAT8以低表达为主。我们进一步采用实时定量PCR技术，结果发现NAT8在CCRCC中的表达水平明显低于其配对的癌旁正常肾组织（P=0.003）。该结果表明NAT8的低表达可能与CCRCC相关。本研究中，我们发现NAT8表达与肿瘤大小、肿瘤分级及TNM分期相关，其中，肿瘤直径≥7cm患者中NAT8低表达患者比例明显高于肿瘤直径＜7cm的肿瘤患者，中等分化患者中NAT8低表达患者比例高于高分化患者。Ⅱ期患者中NAT8低表达患者比例明显高于I期患者。因此，我们认为NAT8低表达与CCRCC的发生、发展相关。另外，本研究随访过程中有2例患者死亡，均为肿瘤组织NAT8低表达患者，但应考虑肿瘤分期分级的影响及样本量较少、随访时间短等因素。

总之，本研究表明NAT8在CCRCC中表达下调，其表达水平与CCRCC的发生及发展相关。检测NAT8表达量有望为CCRCC患者个体化治疗及随访提供依据，改善CCRCC患者预后。然而，因样本量少、随访时间短、失访率高等因素，NAT8低表达与CCRCC进展的相关性以及与患者预后的相关性尚有待后续在细胞水平、动物模型水平进一步行功能及机制的相关研究。