CaO/ZnO核—壳结构纳米材料的细胞毒性评价*

梁 超 王丽丽 刘欣辰 陈晓博 粟缀孜 刘 霞 李祥伟

吉林大学口腔医学院 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林省长春市 130021

根管治疗术是治疗牙髓病和根尖周病的首选方法，根管充填是整个治疗过程的终末环节和关键步骤，是利用根管充填材料严密封闭根管系统，隔绝根管和口腔或根尖周组织的交通，可以促进根尖周边的愈合，防止再感染[1]。根管封闭剂是根管充填材料的组成部分，我们前期制备的CaO/ZnO壳—核结构纳米球材料具有良好的根管封闭性和抑菌性能[2]，本研究是检测CaO/ZnO壳—核结构纳米球材料的细胞相容性，为其作为一种新型根管封闭剂的临床试验奠定体外细胞学的实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 本课题组前期制备的CaO/ZnO核—壳结构纳米球[2]，倒置相差显微镜 (OLYMPUS IX71,Olympus,日本)，TGA-16G-A 低温高速离心机(上海安亭离心机械厂)，CO2恒温细胞培养箱 (MCO20IL,SANYO,日本)，必兰根充糊剂(法国必兰公司)；AH-plus根管封闭剂(DENTSPLY)，DMEM 高糖培养基(H-DMEM) (Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青霉素链霉素溶液(Gibco)；MTT(Amresco)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma)； L929小鼠成纤维细胞系。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂浸提液制备：取适量CaO/ZnO核—壳结构纳米球粉末与丁香油酚调拌呈糊状，压扁切成块状，在37℃、100%湿度的恒温箱中固化48h后，研磨成粉末后称取样品1 000mg，加入5ml无血清H-DMEM培养基，使得材料浸提液的浓度为200g/L，密封后37℃震荡3d，用孔径为0.22μm的滤菌器滤菌，作为储存液，记为CaO/ZnO纳米组。必兰根充糊剂、氧化锌丁香油酚糊剂和AH-plus根充糊剂按照相同的方法制取浸提液，分别记为必兰组、ZOE组和AH-plus组，采用含血清的H-DMEM稀释成不同浓度2.5g/L、5g/L、10g/L和20g/L用于后面的实验。

1.2.2 L929细胞培养：从液氮内取出L929细胞进行复苏，在含10%胎牛血清、100IU/L链青霉素和100mg/L链霉素的H-DMEM培养基内，在37℃、5%CO2培养箱中培养。每3d换液1次，细胞至90%汇合时消化传代，取对数生长期细胞进行下列实验。

1.2.3 细胞形态学观察：将密度为1.0×105cell/ml的L929细胞接种于24孔培养板，每孔1ml，在接种后第2天加入含CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂浸提液2.5g/L、5g/L和10g/L的H-DMEM，每个浓度3孔，培养1d后在倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.4 MTT法进行细胞毒性分析：取对数生长期L929细胞以1×104/孔接种于96孔板，培养24h后加入含不同浓度浸提液的细胞培养液，每组设3个平行复孔，以不含材料浸提液的孔为阴性对照组。在37℃、5%CO2条件下培养1d、3d、7d时，每孔加入20μl MTT(5mg/L)溶液，继续培养4h，去上清后加入DMSO 150μl/孔，摇床轻微振荡10min，选择570nm波长条件下酶标仪检测，测定吸光度值A。计算细胞相对增殖率(Relative growth rate,RGR)，RGR=实验组光密度值/阴性对照组光密度值×100%。根据细胞相对增殖率评价细胞毒性等级[3]，按RGR范围分为5级:RGR≥100%为0级，75%≤RGR≤99%为1级，50%≤RGR≤74% 为2级，25%≤RGR≤49%为3级，1%≤RGR≤24%为4级，RGR=0为5级。0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显的细胞毒性。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行数据统计，数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察检测细胞毒性 L929细胞在浓度为2.5g/L、5g/L和10g/L的CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂浸提液内培养1d时的细胞形态如图1所示。倒置显微镜下观察，空白对照组细胞多呈短梭形，细胞贴壁生长，连接紧密，折光性良好(如图1①～③)，与空白对照组相比，2.5g/L 组(图1④～⑥)及5g/L组(图1⑦～⑨)细胞形态，细胞数量无明显变化，细胞形态良好，未见细胞毒性反应。10g/L组多数细胞形态正常、规则，仅可见细胞数量减少，有少量细胞圆缩、死亡，未呈现明显细胞毒性反应(图1⑩～)。结果说明从形态学角度观察分析，各个浓度组CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂浸提液在培养1d时对L929细胞不具备明显毒性。

图1L929细胞在浓度为2.5g/L、5g/L和10g/L的CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂浸提液内培养1d时的细胞形态

2.2 MTT法检测细胞毒性 不同浓度的CaO/ZnO核—壳结构纳米球组材料浸提液与L929细胞共培养1d、3d、7d时细胞相对增殖率及细胞毒性分析见表1。在材料浸提液浓度较低时，如1.25g/L及2.5g/L时，CaO/ZnO纳米组细胞毒性在各时间点无明显差异，但在浓度至5g/L及以上时，细胞毒性随着培养时间的延长而增大(P<0.05)。在培养时间较短时(如1d)，细胞毒性在各浓度组无明显差异(P>0.05)。在培养至3d时，细胞毒性随浸提液浓度升高而增大(P<0.05)。培养至7d时，细胞毒性随浸提液浓度升高呈现急剧升高趋势，差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表1。

对不同实验材料组细胞相对增殖率结果的分析如图2、3、4，在各个时间点(1d、3d、7d)和各浓度时CaO/ZnO纳米组细胞的相对增殖率均高于必兰组(P<0.05)，在培养3d和7d和高浓度组(>10g/L)时，CaO/ZnO纳米组细胞的相对增殖率高于ZOE组，在各时间点和各浓度时CaO/ZnO纳米组和AH-plus组的细胞相对增殖率无明显差异(P>0.05)，说明CaO/ZnO核—壳结构纳米球丁香油酚糊剂和AH-plus根充糊剂的细胞相容性相似。随着共培养时间的延长，各组细胞的相对增殖率均降低，在共培养1d时，必兰组细胞增殖受到抑制，而且随着浓度的增加细胞相对增殖率也有下降趋势，ZOE组、AH-plus组和CaO/ZnO纳米组对细胞增殖未见影响，在共培养3、7d时，四组材料细胞随着浸提液浓度增加细胞的相对增殖率均有下降趋势，必兰组在各时间点差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

根管充填时使用根管封闭剂的目的主要是充填牙胶尖之间、牙胶尖与根管壁之间的空隙，充填侧副根管和不规则的根管区域，在垂直加压时作为牙胶尖的润滑剂帮助牙胶尖就位以及增加充填材料与牙本质之间的黏附力[1]。根管封闭剂应该具有良好的生物相容性对周围组织和细胞没有毒性[4]。体外细胞培养是检测材料细胞相容性比较简单有效的实验方法，小鼠成纤维细胞 L929细胞系具有细胞培养周期短和细胞存活率高等优点，该细胞系常被广泛应用于材料的细胞毒性检测和评估实验中[5]。本研究采用L929细胞系作为实验对象，采用必兰糊剂、ZOE糊剂和AH-plus根管封闭剂三种临床常用的根管封闭剂作为对照组，检测CaO/ZnO核—壳结构纳米球—丁香油糊剂的细胞毒性以评价CaO/ZnO核—壳结构纳米球材料的细胞相容性。

表1 材料浸提液与L929细胞共培养1d、3d、7d细胞相对增殖率及细胞毒性

图2各组材料浸提液在不同浓度与L929共培养1d时细胞相对增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

图3 各组材料浸提液在不同浓度与L929共培养3d时细胞相对增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

本实验从细胞形态学上分析，在材料浸提液作用1d时倒置显微镜下观察不同浓度的CaO/ZnO核—壳结构纳米球浸提液对L929细胞的细胞形态和排列没有明显的影响，说明材料对细胞没有明显的早期不良刺激反应和细胞毒性。

图4 各组材料浸提液在不同浓度与L929共培养7d时细胞相对增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

MTT比色法是检测细胞增殖常用的实验方法，通常用细胞相对增殖率作为评价指标。本研究采用MTT法检测的实验结果表明CaO/ZnO核—壳结构纳米球材料组对细胞相对增殖率的影响与AH-plus类似，短时间接触(共培养1d)对细胞增殖没有抑制作用，各个浓度间无明显差异(P>0.05)，随着共培养时间的延长(3d)以及随着浸提液浓度的升高 5g/L ，材料的细胞毒性有逐渐增大趋势(P<0.05)。这与Huang等人的研究结果相似[6]，提示在临床应用中，需合理控制材料的浓度和用量，以避免材料的毒性反应。

本实验发现在相同的时间点相同浓度的AH-plus 和CaO/ZnO核—壳结构纳米球材料组之间的细胞相对增殖率不具备统计学差异，说明CaO/ZnO核—壳结构纳米球材料与AH-plus的细胞毒性相似，具有优良的生物相容性。

综上，通过本实验的研究表明我们课题组前期制备的CaO/ZnO核—壳结构纳米球材料作为根管封闭剂在一定的浓度范围没有细胞毒性，具有良好的细胞相容性，是临床应用前景较好的一种新型根管封闭剂。