miR-17-5p通过介导自噬调节胶质瘤U251细胞放射敏感性

田建国，王春宇，姜 民，毛铁铸*

(1.吉林省辐射环境监督站，吉林 长春130000；2.吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041；3.吉林大学公共卫生学院，吉林 长春130021)

自噬是机体对废用的蛋白和细胞器进行降解，并对一些糖类、蛋白质再利用的过程，在细胞稳态的维持中发挥重要作用[1]。自噬在肿瘤的发生发展中发挥着促癌或抑癌的双向作用，在胶质瘤的放疗或化疗过程中，自噬在不同肿瘤分型或治疗方案中可能导致促进治疗或抵抗治疗的不同作用[2]。对肿瘤细胞自噬分子机制的研究和自噬调控因子的发掘必将有益于个性化治疗方案制定。

miRNA是包含20-25个核苷酸的非编码内源性RNA分子，能够通过对目标mRNA的降解起到转录负调控的作用，在真核生物细胞中广泛存在[3]。在多种肿瘤中，miRNA通过调控细胞自噬通路发挥作用。miR-17-5p(miRNA-17-5p)是miR-17(miRNA-17)家族的一员，在哺乳动物器官发育中发挥重要作用，并在包括恶性胶质瘤[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌等多种肿瘤中存在高表达。miRNA在肿瘤细胞中的异常表达，在调节肿瘤细胞的放射敏感性方面发挥着重要作用[7]。鉴于miR-17-5p在胶质瘤放射敏感性及自噬中的调控作用尚未见报道，本研究旨在分析miR-17-5p在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用，并初步探讨其分子机制，以期为胶质瘤的放疗增敏治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂人胶质瘤U251细胞株购自美国模式培养物集存库；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素和链霉素购自美国Hyclone公司；anti-miRNA-17(AmiR-17-5p)反义寡核苷酸和阴性对照反义寡核苷酸购自上海生工公司；lipofectamine TM2000试剂盒购自碧云天生物技术研究所；CCK8试剂盒购自北京天根公司；RT-PCR 试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；pGFP-LC3重组质粒购自上海生工公司；氯喹(chloroquine，CQ)购自美国Sigma公司；MAPLC3抗体、GAPDH抗体、ATG7抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa公司。

1.2 细胞培养与转染U251细胞培养于37℃ 细胞培养箱中，细胞培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基。毎天均使用倒置显微镜观察细胞，待细胞生长至80%-90%融合时传代培养。

AmiR-17-5p反义寡核苷酸和阴性对照反义寡核苷酸购自上海生工公司， AmiR-17-5p 序列为5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’,阴性对照序列为5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。取对数生长期的U251细胞接种于6孔板中，接入数量每孔5.0×105个，在37℃ CO2细胞培养箱中孵育24 h。孵育后，按lipofeetamineTM2000说明书进行转染含目标序列的质粒。设置空白对照组(未转染细胞)、阴性对照组(转染阴性对照序列的细胞)和AmiR-17组(转染AmiR-17-5p序列的细胞)。

1.3 照射方法GC3000 Elan辐射器(MDS Nordion,加拿大)，X-射线，电压180 kV，电流18.0 mA，滤板为0.25 mm Cu和1.0 mm Al，剂量率0.40 Gy · min-1，源皮距60 cm。

1.4 CCK8实验取对数生长期的细胞于96-孔板中，接入数量每孔5.0×103个，在37℃ CO2细胞培养箱中孵育24 h。孵育后，5 Gy X-射线辐射处理细胞，设5个复孔，37℃ CO2细胞培养箱中培养48 h。培养结束后，每孔加入20 μl CCK8试剂，避光孵育4 h。使用酶标仪测定在OD450 nm处各孔的吸光值，细胞存活率=给药组OD值/空白对照组OD值。

1.5 实时定量PCRmiR-17-5p引物由上海生工公司合成，上游引物为5’-CCCACCCAGCCTGGCGCCAGAACTGCACACGTACACTATGTGG-3’，下游引物为5’-CCACATAGTG TACGTGTGCAGTTCTGGCGCCAGGCTGGGTGGG-3’。用RNA分离试剂抽提细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行实时定量PCR反应。实时定量 PCR 扩增条件为：(95℃ 4 min→95℃ 30 s→52℃ 30 s→73℃ 30 s)×40。

1.6 GFP-LC3形态学分析自噬磷酸钙共沉淀法转染构建稳定表达的U251细胞 GFP-LC3细胞模型。pGFP-LC3重组质粒由上海生工公司合成，取对数期生长的细胞于6孔板中，接入数量每孔5.0×105个，在37℃ CO2细胞培养箱中孵育24 h，按lipofeetamineTM2000说明书进行转染。稳定转染的U251细胞使用脂质体转染阴性对照序列和AmiR-17-5p序列，24 h后给予5 Gy X-射线辐射处理，辐射后20 h，应用倒置荧光显微镜观察细胞自噬情况，并获取照片。以细胞中有10个以上自噬空泡的细胞为自噬阳性的细胞计数，分析各组自噬水平。

1.7 western bloting取对数期生长的细胞于6孔板中，接入数量每孔5.0×105个，AmiR-17-5p转染后24 h或5 Gy X-射线照射后8 h，收集细胞，100 μl冰预冷的蛋白裂解液充分裂解细胞，离心收集上清液。使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，上样20μg蛋白行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳条带转移至硝酸纤维膜，室温条件下的封闭液中孵育30 min，与一抗室温孵育60 min，洗膜后与二抗孵育60 min。显色后的条带使用Gel-Pro 凝胶成像系统灰度扫描，使用Quantity One软件分析光密度值。

2 结果

2.1 放射对胶质瘤U251细胞miR-17-5p表达的影响给予U251细胞5 Gy X-射线照射，抽提总RNA，经qRT-PCR检测发现miR-17-5p表达在照射后8 h内上调，而在照射8 h后miR-17-5p表达逐渐回落，其中4 h时U251细胞miR-17-5p是模拟照射组时3.1倍(P=0.001)。U251细胞使用anti-miRNA-17的慢病毒转染，AmiR-17组经模拟照射和5 Gy X-射线照射，4 h后， miR-17-5p表达均明显降低，显著低于模拟照射+阴性对照组(P=0.008，P=0.006)；而阴性对照组与空白对照组类似，照射后4 h miR-17-5p表达明显升高(P=0.001)。

2.2 miR-17-5p增加辐射对胶质瘤U251细胞增殖活性的抑制作用U251细胞经过5 Gy X-射线照射后，连续培养48 h，使用CCK-8法分析细胞增殖能力。以模拟照射+空白对照组细胞存活率为100%，模拟照射+AmiR-17组48 h细胞存活率为87.5%，相对于模拟照射+空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；5 Gy照射+AmiR-17组48 h细胞存活率分别为33.6%，明显低于5 Gy照射+空白对照组(P=0.037)，且明显低于模拟照射+空白对照组和模拟照射+ AmiR-17组(P=0.003，P=0.009)；阴性对照组和空白对照组间均没有明显差异(P>0.05)。

2.3 AmiR-17-5p在胶质瘤U251细胞中增强辐射诱导的自噬为探究miR-17-5p对X-射线诱导胶质瘤细胞自噬的影响，本研究构建了稳定表达GFP-LC3的U251细胞模型，荧光显微镜观察发现，U251细胞本底水平的自噬约为7%，5 Gy照射后，自噬水平升高至35%(P<0.001)。脂质体转染后，阴性对照组和AmiR-17组自噬水平分别为6%和7%，没有明显变化(P>0.05)。5 Gy照射后，阴性对照和AmiR-17组自噬水平明显升高，分别为34%和51%，两者差异有统计学意义(P=0.026)。

为进一步验证miR-17-5p对辐射诱导U251细胞自噬的影响，使用Western blotting方法检测MAPLC3蛋白水平变化。U251细胞经过5 Gy X-射线照射后8 h后提取蛋白，使用Quantity One软件分析蛋白电泳结果，以阴性对照组LC3II/LC3I值为1。AmiR-17组LC3II表达水平明显升高(LC3II/ LC3I=1.44)，差异有统计学意义(P=0.021)。氯喹(chloroquine，CQ)能够通过溶酶体抑制自噬的进程，导致自噬小体的累积，增加自噬通量评价的准确性。使用加入CQ处理后，阴性对照组LC3II/ LC3I值升高至1.47，AmiR-17组LC3II/ LC3I值升高至1.97，差异有统计学意义(P=0.036),提示AmiR-17组X-射线诱导的U251细胞自噬明显增强，见图1。

图1 miR-17-5p在胶质瘤U251细胞中增强辐射诱导的自噬

NC为阴性对照组，CQ为氯喹组

2.4 AmiR-17-5p在胶质瘤U251细胞中抑制辐射诱导的ATG7表达下调为探究miR-17-5p对胶质瘤细胞自噬相关蛋白的影响，使用Western blotting方法检测ATG7蛋白水平变化。U251细胞AmiR-17-5p转染24 h或5 Gy X-射线照射后8 h后提取蛋白，使用Quantity One软件分析蛋白电泳结果。AmiR-17-5p转染后，AmiR-17组ATG7表达水平明显高于阴性对照组(P=0.010)；5 Gy X-射线照射后，阴性对照组ATG7表达水平降低，但相对于照射前没有统计学意义(P>0.05)，AmiR-17-5p转染后，AmiR-17组ATG7表达水平明显高于阴性对照组(P=0.003)见图2。

图2 AmiR-17-5p在胶质瘤U251细胞中抑制辐射诱导的ATG7表达下调

mock为模拟照射组， NC为阴性对照组，IR为5 Gy X-射线照射组

3 讨论

胶质瘤是脑部常见的恶性肿瘤，约占全部脑部恶性肿瘤的40%-50%，其恶性增殖和侵袭行为导致常见放化疗耐受，患者中位存活时间仅为14.6个月。放疗抗性的产生是胶质瘤放疗失败的重要原因，但随着治疗疗程的增加，胶质瘤放疗的临床疗效逐渐降低[8]。胶质瘤的放疗抗性是影响放疗疗效的重要因素，当前胶质瘤放疗抗性产生机制并未得到清晰阐明。

自噬是一种保守的进化过程，细胞通过降解和循环胞内成分维持细胞稳态。自噬在肿瘤中具有双重功能，自噬能够作为细胞稳态维护机制发挥抑癌作用，又能在在环境应激下维持肿瘤细胞度过不利条件，可能影响到肿瘤的辐射抗性[9]。miR-17-5p是miR-17家族的一员，在哺乳动物器官发育中发挥重要作用，并在包括恶性胶质瘤[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌等多种肿瘤中存在高表达。当前研究表明，miRNA通过与自噬相关基因的调控作用调控自噬。miR-17-5p能调控ATG7、STMN1、RAB5A等多种自噬相关基因，在自噬的不同阶段发挥调控作用[10]。而miR-17-5p在胶质瘤放射敏感性及自噬中的调控作用尚未见报道。

本研究分析胶质瘤U251细胞株X-射线照射后miR-17-5p的表达变化，发现U251细胞在放射后8 h内均表现出明显的miR-17-5p表达上调，这提示miR-17-5p在U251细胞放射过程中发挥作用。Pasi [11]在胶质瘤细胞株T98G中敲除了miR-17-5p表达，发现敲除miR-17-5p表达后T98G细胞体外增殖能力降低，细胞凋亡率升高，小鼠异种移植瘤生长被抑制。为此，本研究采用慢病毒转染的方法降低了U251细胞miR-17-5p表达，miR-17-5p表达的下调明显降低了在放射条件下U251细胞的增殖能力，提示miR-17-5p下调能够提高胶质瘤U251细胞的辐射敏感性。

电离辐射诱导胶质瘤细胞自噬有较多的报道，其机制也得到了不同水平的阐释。本研究中，经过GFP-LC3形态学检测确认，5 Gy X-射线照射后U251细胞自噬明显激活，慢病毒转染降低miR-17-5p表达后，U251细胞自噬水平进一步提高，提示miR-17-5p下调提高的辐射敏感性与增强自噬有关。MAPLC3是构成自噬小体重要的蛋白，MAPLC3 II的表达情况能够用于分析细胞自噬通量；氯喹是自噬晚期阶段的抑制剂，阻滞自噬的进程，能够增加自噬通量评价的准确性[12]。本研究通过western bloting分析了LC3II/ LC3I值，发现慢病毒转染降低miR-17-5p表达后，U251细胞自噬通量明显提高，并且加入氯喹进一步确认了结果，提示miR-17-5p在电离辐射诱导MCF7细胞发挥着抑制自噬激活的作用。

自噬相关基因7(autophagy related gene 7，ATG7)是重要的自噬相关基因，ATG7在自噬体的形成过程中起到了重要的调控作用[13]。并且据新近的报道，miR-17-5p能通过抑制ATG7而抑制电离辐射诱导的肝癌HePG-2细胞的自噬[14]。本研究中，5 Gy X-射线照射后U251细胞ATG表达7略微降低，这与放射导致的细胞死亡有关；慢病毒转染降低miR-17-5p表达后，U251细胞ATG7明显提高，这提示miR-17-5p通过抑制ATG7调节胶质瘤U251细胞自噬过程。

综上所述，本研究丰富了miR-17-5p-自噬调控网络，发现miR-17-5p作为胶质瘤细胞的自噬调控miRNA，能够抑制ATG7的表达并改变胶质瘤细胞辐射敏感性。为乳腺癌的临床靶向治疗提供了实验依据，但miR-17-5p对靶基因的调控机制还需更多的工作深入的研究。