血清中DCLK1在非小细胞肺癌中的表达及应用价值

陈贤真,乔建瓯

(上海交通大学医学院附属第九人民医院 呼吸内科,上海200001)

2018年全球癌症最新统计调查显示,肺癌的发病率和死亡率目前均居恶性肿瘤中的第1位,比例分别为11.6%和18.4%[1],由于肺癌起病隐匿,且缺乏特异性症状,约65%的患者确诊时已处于肿瘤的中晚期[2],5年生存率不足15%,因此对于肺癌高危人群,临床上需要快速、无创、经济及高灵敏度的筛查方法。CT的广泛应用虽然有效提高了肺癌的早期诊断率,但同时也存在假阳性率高、经济成本高以及辐射损伤的缺点,而目前用于肺癌早期诊断的临床生物标志物敏感度及特异度又相对不高[3],因此,临床上迫切需要寻找具有更高诊断价值的新型肿瘤标志物,以提高肺癌的早期诊断率。

双皮质素样激酶 1(doublecortin-likekinase 1,DCLK1)是具有两个双皮质素(DCX)结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶,最初被认为是神经元形成和迁移的关键调节因子,并具有微管聚合的功能[4]。目前累积的临床证据支持DCLK1与肿瘤侵袭性相关,并在癌症干细胞中表达,为癌细胞提供肿瘤起始能力[5],并在功能上参与多种恶性肿瘤的生长、上皮-间质转化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)及转移过程[6],抑制DCLK1表达可促进肿瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表达增加,使肿瘤生长停滞[7,8],并同时抑制肿瘤EMT过程[8]。然而,目前关于DCLK1在肺癌中的研究还较少,外周血DCLK1表达含量和非小细胞肺癌患者的临床关系尚未有相关报道,鉴于DCLK1在恶性肿瘤中表现出来的成瘤性,因此本课题通过检测血清中DCLK1表达水平,初步探讨DCLK1与肺癌的相关性,并与CEA对比,评价DCLK1在NSCLC患者中的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集我院2018年1月至2018年6月经病理及影像学确诊的95例NSCLC患者静脉血样本,标本获取前患者均未接受行手术、化疗及药物治疗,并排除有肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等肺部良性疾病,合并其它脏器疾病,合并自身免疫性疾病,有其它恶性肿瘤病史的患者。其中男性56例,女性39例,平均年龄(66.39±12.56)岁。肺癌的组织学分类采用2015年WHO标准[9],入组鳞癌患者39例,腺癌56例,临床分期按照2009年IASLC公布的第七版TNM分期标准[10],共纳入Ⅰ期19例,Ⅱ期16例,Ⅲ期22例,Ⅳ期38例。年龄、性别以及吸烟史差异在肺癌患者中均无统计学意义(P>0.05,见表1)。另选取同时期我院62例健康体检者作为对照组,纳入对象身体状况良好,均证实无系统性疾病及恶性肿瘤病史,其中男性30例,女性32例,平均年龄(55.44±9.48)岁。所有受试者于入院第2天清晨空腹采集肘正中静脉血2 ml于EDTA管内,立即送往我院中心实验室,每管样本经高速离心后取上层血清200 μl,在-80℃下储存备用。本研究经我院医学伦理委员会审核批准,所有受试人员均知情同意。

1.2 方法

采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清样本中DCLK1 的含量。DCLK1 ELISA试剂盒采购于武汉伊莱瑞特生物科技公司,试剂盒检测范围：(0.16-10)ng/ml。采用双抗体夹心法,操作步骤严格按照产品说明书进行。简要步骤如下：向已包被人DCLK1抗体的96孔板中加入100 μl标准品和待测样品,37℃孵育90 min；弃去孔内液体,每孔加入100 μl生物素化抗体工作液,37℃孵育60 min；洗涤3次,每孔加入100 μl HRP酶结合物工作液,37℃孵育30 min；洗涤5次后加入90 μl底物溶液,37℃孵育15 min；加入50 μl终止液,立即用全自动酶标仪(美国THERMO公司)在450 nm波长下测量各孔的光密度值(OD值),最后带入标准曲线方程中计算相应的DCLK1浓度。CEA的检测由我院检验科采用电化学发光免疫分析法完成。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康组中血清DCLK1表达情况比较

NSCLC患者血清DCLK1表达水平为(6.541±3.002)ng/ml,健康组为(2.802±1.363)ng/ml,DCLK1在非小细胞肺癌组中的表达水平明显高于健康对照组,差异有统计学显著意义(t=10.582,P<0.001,见图1)。

图1 肺癌患者和健康者血清中DCLK1表达水平

2.2 血清中DCLK1表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系

通过对DCLK1与NSCLC患者临床病理资料进行比较分析,我们发现NSCLC患者血清DCLK1水平与肿瘤的大小、病理类型、TNM分期、分化程度、淋巴结转移均密切相关,其中鳞癌、中晚期、中低分化和淋巴结转移阳性的患者中血清DCLK1表达水平分别高于腺癌、早期、高分化和淋巴结转移阴性的患者,两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 血清中DCLK1表达水平与NSCLC患者临床病理特征之间的关系

2.3 DCLK1和CEA对NSCLC患者的临床诊断价值比较

通过ROC曲线对比分析(见图2),结果显示DCLK1和CEA对于区分NSCLC患者和健康者的曲线下面积(areaunderthecurve,AUC)分别为0.879(95%CI,0.817?0.925,P<0.001)和0.799(95%CI,0.728-0.859,P<0.001),面积差异有统计学意义(P=0.044),DCLK1用于诊断NSCLC的最佳阈值为4.904 ng/ml。基于上述结果,我们进一步分析比较了DCLK1和CEA对于早期和中晚期NSCLC的诊断价值,结果显示DCLK1和CEA诊断Ⅰ-Ⅱ期肺癌患者的AUC分别为0.747(95%CI,0.649-0.830,P<0.001)和0.653(95%CI,0.550-0.747,P=0.012),诊断Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者的AUC分别为0.939(95%CI,0.881-0.974,P<0.001)和0.885(95%CI,0.814-0.935,P<0.001),DCLK1对于早期和中晚期NSCLC患者的诊断效能均高于CEA,见表2。

图2 A血清DCLK1、CEA诊断肺癌的ROC曲线;B血清DCLK1、CEA诊断Ⅰ-Ⅱ期肺癌的ROC曲线;C血清DCLK1、CEA诊断Ⅲ-Ⅳ期肺癌的ROC曲线

表2 DCLK1和CEA对于NSCLC患者不同临床分期的诊断指标评价

2.4 肺癌患者和健康者血清DCLK1表达水平与CEA之间的相关性

通过对157例NSCLC患者和健康者血清中DCLK1与CEA表达水平进行Spearman相关性分析,结果显示血清DCLK1与CEA表达水平之间呈线性正相关(r=0.478,P<0.001),见图3。

图3 血清DCLK1与CEA表达水平的相关性分析

3 讨论

DCLK1氨基酸N末端与双皮素(DCX)有65%的相同结构,C末端由与Ca2+/钙调蛋白高度相关的丝氨酸/苏氨酸结构域组成,过去也被称为DCAMKL1[4]。既往认为DCLK1作为一种微管相关激酶,在神经元迁移,轴突运输,突触成熟和大脑发育中起重要作用。近年来有研究显示,DCLK1表达阳性的细胞具有肿瘤干细胞特性[11,12],并在胰腺癌[13]、胃癌[14]、肝细胞癌[15]、食管癌[16]等多种癌症中过度表达。Sureban等人在小鼠胰腺癌和结肠癌模型中,利用siRNA介导的 DCLK1 mRNA沉默效应,可使肿瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表达增加,肿瘤体积明显缩小,并使癌基因c-MYC及KRAS的mRNA表达量降低45%[7,8]。在肾细胞癌的研究中,将肿瘤组织内注射DCLK1单克隆抗体CBT-15后,发现具有明显的肿瘤抑制效应,同时能增加肾癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂药物的敏感性[17]。此外,DCLK1还能通过增加NF-κBp65蛋白表达,促进结肠癌的上皮-间质转化(EMT)[18],肿瘤经历EMT过程后,细胞间极性和基底膜消失,肿瘤侵袭和转移能力随之增强,EMT也被认为是肿瘤侵袭机制中重要的早期步骤[19],因此DCLK1可能通过上述多种机制影响肿瘤的形成和发展。

本实验结果显示DCLK1在NSCLC患者血清中高表达,且与肿瘤临床分期、分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移密切相关。一般而言,肿瘤的低分化和淋巴结转移阳性往往预示着其具有更强的组织侵袭性和恶性程度,不同TNM分期则与肿瘤负荷及预后相关,提示DCLK1可以为评估NSCLC的生物学行为及临床分期提供一定的参考价值。然而本课题与周美玲[20]等人的研究结果有所不同,原因可能与DCLK1在肺癌组织和外周血中的表达水平存在差异有关。国外曾有文献报道,约50%的肺癌患者血清中DCLK1基因启动子存在甲基化现象,并与预后不良相关[21],因此我们推测DCLK1在肺癌中的高表达或许可间接反映这一过程。在不同病理类型的比较中,我们发现鳞癌患者血清中DCLK1水平明显高于腺癌,这与Tao等人在肺癌组织中的研究结果相一致[22],提示不同的病理类型可能会对DCLK1表达水平产生一定的影响。

通过ROC曲线分析,我们发现在不同临床分期的NSCLC患者诊断中,DCLK1的ROC曲线下面积及约登指数均高于CEA,并且对于早期和中晚期患者的诊断敏感度优于CEA,提示DCLK1用于肺癌诊断具有较高的临床应用价值,并有望成为肺癌筛查和诊断的潜在新型肿瘤标志物。

综上所述,外周血中DCLK1表达水平在NSCLC患者中存在明显的肿瘤相关性,并且DCLK1在NSCLC诊断上具有较高的临床应用价值,检测外周血DCLK1水平可以为患者的病情评估及肿瘤诊断提供一定的参考价值。由于本研究的样本量较少,今后尚需扩大临床病例数来进一步评价DCLK1对肺癌诊断的价值,未来还可进一步设计前瞻性研究,探讨外周血DCLK1表达水平与肺癌患者生存期及预后的关系。