红景天甙影响SACC-2细胞凋亡途径相关蛋白表达的体外研究

张晓恬,林佳慧,杨 格,范婧婧,高志琴,王医术,李美华*

(1.吉林大学第二医院 口腔科，吉林 长春130041;2.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室,吉林 长春130021)

红景天甙(Salidroside)也称红景天苷，其取自景天科红景天属植物大株红景天干燥的全草、根茎，是红景天中高活性、最有效的成分之一。红景天作为一种传统的天然中草药，被认为具备增强免疫水平、抗疲劳、抗氧化及抗肿瘤等多种作用，在国内已有广泛研究与应用[1]。红景天抗肿瘤作用的相关研究显示，红景天苷能够通过下调Bcl-2的表达水平诱导人BC细胞的周期停滞和凋亡，也可通过增加脾淋巴细胞转化率和IL-2值来明显抑制人胃癌细胞系BGC-823的生长，反映了其在抗肿瘤药物治疗方面的良好前景[2,3]。然而，涎腺腺样囊性癌(saliva adenoid cystic carcinoma，SACC)作为最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，临床上少有红景天甙对此种肿瘤的作用及其机制的研究，因此，本实验拟通过Western blot实验检测不同浓度红景天甙处理对SACC-2细胞凋亡途径相关蛋白如Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ表达的影响，观察红景天甙作用于SACC细胞后对其增殖及凋亡影响的药理作用，并探究其可能发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红景天甙由吉林省中研药业有限公司提供；标准胎牛血清由天津灏洋生物公司提供；胰蛋白酶(GIBCO公司)；BAX、BCL-2、LC3(abcom公司，USA)；超净工作台(SW-CJ-1F)、CO2恒温培养箱、4℃冰箱、-80℃超低温冰箱由吉林大学病理生物学教育部重点实验室提供。

1.2 细胞总蛋白样品制备

实验分为对照组与红景天甙用药组，SACC-2细胞在10%胎牛血清的1640培养基中培养，将2.5 μg/ml及5 μg/ml浓度的红景天苷分别加入用药组的培养基中。待每皿内细胞的融合程度达90%左右，弃培养基，胰酶消化离心，冰上裂解30 min，每5 min涡旋一次。并运用BCA试剂法测定蛋白浓度，按照计算显示蛋白浓度配置电泳所需蛋白样品，备用。

1.3 Western Blot分析

SDS—PAGE电泳，浓缩胶恒压80V，40 min；分离胶恒压120V，3 h。电泳结束手转膜，转膜采用半干转，恒压，40 min；后将PVDF膜在5%的脱脂奶粉封闭液中浸泡，封1 h，室温下摇床孵育；然后加入一抗、二抗，TBST洗膜3次/10 min,之后进行化学发光反应；ECL显色。

1.4 统计学分析

实验结果的数据统计及数据统计的分析分别采用均数±标准误(Mean±SE)和SPSS17.0，而单变量两组资料间比较和参数间相关分析则分别采用t检验和Pearson检验，P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

Western blot实验结果显示，促凋亡蛋白BAX在2.5 μg/ml用药组的表达与对照组相比差异不明显，但5 μg/ml用药组的与对照组及2.5 μg/ml用药组相比表达均降低(对照组&2.5 μg/ml用药组，P>0.1；对照组&5 μg/ml用药组，P<0.0001；2.5 μg/ml用药组&5 μg/ml用药组，P<0.0001)，抗凋亡蛋白BCL-2表达降低(对照组&2.5 μg/ml用药组，P<0.05；对照组&5 μg/ml用药组，P<0.05；2.5 μg/ml用药组&5 μg/ml用药组，P<0.05)，但BCL-2/bax比值降低(对照组&2.5 μg/ml用药组，P=0.1431；对照组&5 μg/ml用药组，P<0.05；2.5 μg/ml用药组&5 μg/ml用药组，P<0.05)。与对照组相比，2.5 μg/ml用药组和5 μg/ml用药组自噬相关蛋白LC3-Ⅰ表达均降低，LC3-Ⅱ表达均增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高(对照组&2.5 μg/ml用药组，P<0.05；对照组&5 μg/ml用药组，P< 0.05)。(图1、表1)

图1 不同浓度红景天甙对SACC-2细胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ表达的影响

表1 Western blot检测不同浓度红景天甙对SACC-2细胞凋亡途径相关蛋白表达影响的统计分析

3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)与细胞自噬(autophagy)被认为是机体内程序性细胞死亡((programmed celldeath,PCD)的两种重要形式，也是维持体内细胞稳态的重要手段。凋亡是细胞为维持体内稳定的内环境而按照一定规律和程序自动停止生命的基本生物学现象，而肿瘤细胞在过度增殖及凋亡程序的紊乱两方面的行为改变往往会导致恶性肿瘤的产生。因此，实现促进细胞凋亡过程的再启动被认为是治疗肿瘤行之有效的方法之一，目前临床上许多化疗药物均是通过诱导或上调肿瘤细胞凋亡水平来发挥其药理作用[4]。而生理水平的自噬则是机体内一种保守的细胞自我降解方式，通过清除、降解细胞内受损细胞及生物大分子，为细胞的修复、重建和再生提供原料，实现细胞内物质的再利用。自噬水平异常(过度或不足)均可能致使有关疾病的产生有可能因为，肿瘤细胞在氧分、血供及营养不足、肿瘤对抗治疗等这类细胞“恶性”外部代谢环境下体现出的调亡抵抗，可以提高其逆境生存的能力。细胞自噬作为肿瘤细胞逃逸凋亡的某种特殊作用机制，正逐渐作为肿瘤发生机制与对抗治疗研究中的热点而被关注[5]。

本实验中，为了验证不同浓度红景天甙影响SACC-2细胞凋亡的药理效用，我们采用Western blot实验测试了Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ等多种蛋白的表达水平。Bcl-2与Bax同属于Bcl-2家族，该凋亡调控基因表达的这两种重要蛋白可聚合为同/异源二聚体来发挥其对细胞凋亡的调节作用。当下对Bcl-2普遍认认知是其可以通过对凋亡基因Bax产生对抗作用，或拮抗细胞色素c的释放，以及阻止caspase被包含于胞质中的细胞色c激活，从而发挥其抗凋亡机制[6,7]。有研究显示Bax/Bcl-2 两种凋亡相关蛋白之间的比例大小能够在某种水平上体现细胞凋亡受抑制作用的强度水平，因此可以认为，Bax 是促进细胞凋亡的基因中较为重要的一种。而自噬标志物LC3在形成自噬反应时，LC3-Ⅰ会因某一多肽小片段的酶解而转化为LC3-Ⅱ，因此根据LC3-Ⅱ/Ⅰ比例的改变，可以预估细胞自噬反应程度的高低[8]。

后续检测结果显示，2.5 μg/ml红景天甙用药组蛋白表达差异不明显，5 μg/ml红景天甙用药组与对照组相比，Bax表达亦降低，Bcl-2表达降低，但Bcl-2/Bax比例值也同样降低，该比值减低说明与对照组相比，5 μg/ml红景天甙用药组抗凋亡作用弱于促凋亡作用。而LC3表达情况的检测结果则反映，随着红景天甙浓度的上升，LC3-Ⅰ表达降低，LC3-Ⅱ表达增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高，由此可以认为红景天甙能够导致SACC-2细胞自噬水平的增加。

本研究证实了红景天苷能够通过促进SACC-2的凋亡来抑制其增殖，从而发挥其肿瘤治疗作用，其机制可能与细胞自噬调节相关。我们将通过后期体内研究进一步明确红景天苷在抑制SACC细胞增殖反应中的分子作用机制。