(1,3)-β-D-葡聚糖在不同证据级别的侵袭性肺曲霉病中的表现

张鑫强,陈慧敏,刘素玲,凌 勇,叶 龙,赵 越,陈晓丽,周典蓉,李正康

(广东省人民医院 检验科，广东省医学科学院,广东 广州510080)

侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)是临床常见的肺部感染性疾病,特别是在免疫力低下或者有严重基础疾病的患者中常见,比如造血干细胞移植患者、固体器官移植患者、重大手术患者、艾滋患者以及其他免疫抑制治疗的患者。这些患者往往缺乏典型的临床表现,早期诊断的效果也不理想。一项多中心的研究报道[1],在危重症患者中,根据欧洲癌症研究和治疗组织和美国真菌病研究组(EORTC/MSG)2008年修订的侵袭性真菌分级标准[2],94例患者为确诊(proven) 级别的侵袭性曲霉感染(占17%),该级别患者的病死率高达79%。德国一项前瞻性的多中心队列研究显示[3],发生IPA的血液病患者84天病死率为33.8%(49/145),归因病死率为26.9%。来自台湾的IPA病例分析报告也显示,在2002-2012年间,407例IPA患者的整体病死率也达到30.22%[4]。IPA的致死率很高,因此,早期快速诊断曲霉具有重要的临床价值。目前常用的诊断方法有半乳甘露聚糖(GM)、(1-3)-β-D- 葡聚糖(G实验)、真菌培养、相关抗原抗体筛查和分子检测,目前临床常见的方法是前3种。一项比较G实验和GM实验的研究发现[5],在免疫抑制的机械通气危重症患者中,13例probable IPA患者的G实验结果显著高于无IPA患者(375 pg/mL VS.64 pg/mL,P<0.001),G实验诊断probable IPA的灵敏度和特异度分别为88%和82%,血清GM实验则分别为35%和70%,但肺泡灌洗液的GM实验的灵敏度和特异度的结果分别为70%和94%。由于肺泡灌洗液是有创操作,临床采样较困难,因此无创的血清实验正受到越来越多的重视。本研究根据真菌培养和病理检查的结果,分析了G实验在上述不同检查结果中的表现,从而探索G实验是否可辅助培养和病理检查诊断IPA。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月-2017年12月在广东省人民医院诊断为侵袭性肺曲霉病的患者病例信息,收集患者以下信息：人口学资料、肺穿刺组织病理结果、呼吸道标本(痰、纤支镜冲洗液、肺泡灌洗液)培养结果、(1,3)-β-D-葡聚糖结果。根据2008年EORTC/MSG共识组制定侵袭性真菌分级标准[2],分为3级：确诊、拟诊和疑诊。确诊需要组织病理学依据或者正常无菌部位标本曲霉培养阳性,拟诊患者需符合1项宿主因素、1项临床依据和1项微生物学标准。本研究纳入的病例为确诊和拟诊患者,根据病理和培养的结果分为3组：病理+培养双阳性组、单培养阳性组、单病理阳性组。

1.2 (1,3)-β-D-葡聚糖检测

实验试剂盒购自湛江安度斯生物有限公司,商品名为“真菌(1,3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(光度法)”,严格按照产品说明书进行操作,检测结果解释：阴性：<100.5 pg/ml；灰区(需要连续监测)：100.5-151.5 pg/ml；阳性：>151.5 pg/ml。

1.3 呼吸道标本培养

临床送检的痰或者纤支镜冲洗液均常规接种血平板、沙氏平板、麦康凯平板、含万古霉素巧克力平板,置于5%CO2孵箱37℃培养24-48 h,对排除污染的曲霉菌转接到马铃薯琼脂平板,置于普通孵箱28℃培养48-72 h,进行采用乳酸石碳酸棉蓝染液进行霉菌直接制片观察,根据镜下特征和培养特征进行霉菌的判定。

1.4 统计学分析

采用 IBM SPSS 22.0版本进行统计学分析。计量资料不满足正态分布特征,采用中位数和四分位间距进行描述并制作箱图表示,组间比较采用Kruskal-Wallis H非参秩和检验。计数资料采用构成比进行描述,组间比较采用卡方检验,P<0.05认为差异有统计学意义。组内两两比较进行卡方分割,对P=0.05调整为P1=P/[(k(k-1)/2)+1],k为分组数目。

2 结果

2.1 病例基本特征

94例患者纳入分析,男性46人(占60.5%),女性30人(占39.5%),平均年龄59±21岁,主要的培养标本来源为痰和纤支镜冲洗液。单病理阳性39例(41.5%),病理+培养双阳性10例(10.6%),单培养阳性45例(47.9%)；培养结果显示1种曲霉生长的41例,2种曲霉生长的4例。最后纳入分析的有G实验检验结果的病例是76例(见图1)。

2.2 不同检查结果组别的G实验表现

病理+培养双阳性的标本G实验阳性占70%(7/10),其次是单培养阳性占37.8%(17/45),单病理阳性占14.3%(3/21)。灰区结果只有4例(分别是单培养阳性3例,单病理阳性1例)。三组的G实验阳性率有统计学差异(χ2=9.34,P=0.036)(见表1),进行两两比较发现,a调整为0.0125后,双阳性组的G实验阳性率显著高于单病理阳性组(χ2=9.06,P1=0.004)。以G实验的结果制作箱图发现,双阳性组的G实验中位值[M(P25,P75):249.30 pg/ml(75.5,458.25) ]显著高于单病理阳性[40.30 pg/ml(19.65,74.25)]和单培养阳性组[79.40 pg/ml(22.75,270.60)](χ2=9.806,P=0.007)，见图2。

2.3 霉菌分布和标本的科室来源

55例培养阳性标本中,共培养59株曲霉(4例是2种曲霉生长),最常见的是烟曲霉36例(占61.02%),其次是黄曲霉12例(占20.34%),剩下的是曲霉菌7例(11.86%)、黑曲霉3例(5.08%)和青霉属1例(1.69%)。标本主要来源科室是呼吸内科(40.79%,31/76),危重病监护室(14.47%,11/76血液科占9.21%(7/76),其它科室有27例。

图1 病例筛选流程图

表1 不同证据组别的G实验定性分析结果比较

注：*:病理+培养双阳性 VS.单病理阳性χ2=9.06,P1=0.004

图2 不同证据组别的G实验定量分析结果比较

2.4 不同霉菌的G实验结果分布

剔除掉有2种曲霉生长的病例,5种霉菌的G实验结果如图3所示,烟曲霉的中位值和四分位间距为： 153.30(31.10,484.80) pg/ml；黄曲霉：25.15(19.85,176.32) pg/ml;曲霉菌：262.50(48.00,271.80) pg/ml； 黑曲霉只有2例,其中位值为：112.10 pg/ml；青霉菌只有1例为：66.50 pg/ml。不同霉菌的G实验定量结果比较未发现有统计学差异(H=4.021,P=0.403)。

图3 不同霉菌的G实验结果分布

3 讨论

肺曲霉病临床表现一般不典型,容易被漏诊和误诊,最常见的临床症状是咯血,影像学常见的是肺部结节或者晕征(Halo),特别是在免疫正常人中,症状更不明显,有报道其误诊率高达73%[6]。除了症状不明显,IPA的病程也较长,一项对肾移植患者进行随访的病例对照研究发现[7],移植后大于180发生IPA占54.5%(61/112),大部分的诊断集中在移植后的前36个月(54.1%,33/61),甚至有5个病例在移植10年后发生IPA,发生IPA的患者和对照组比起来,主要的危险因素是高龄[8]、糖尿病[9]、移植前慢性阻塞性肺病[10]、血流感染以及免疫抑制相关并发症[11]。目前治疗肺曲霉的方法主要是抗真菌治疗,比如伏立康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净等,辅助性的治疗包括减停免疫抑制剂、粒细胞集落刺激因子应用或中性粒细胞输注,部分有手术指征的患者可采用手术治疗[12]。

目前诊断肺曲霉的金标准是肺组织病理检查,但由于肺组织活检术后易导致术后出血,患者依从性不高,导致该项侵入性操作难以开展。因此,探讨其它微创或无创的方法辅助诊断IPA就很有必要,比如血清学试验(GM实验和G实验)、PCR和培养法等。有报道在非中性粒细胞缺乏患者中,肺泡灌洗液(BAL)进行GM实验诊断IPA的灵敏度和特异度分别为100.0%和76.2%[13]。BAL是来自于下呼吸道,比较接近于可能的感染灶,是比较理想的标本来源,其检测准确性也高于其它来源的标本,比如血清标本。Zhou等[14]对非粒缺患者同时进行BAL和血清标本的GM抗原检测,发现BAL诊断IPA的灵敏度显著高于血清标本(75.68% VS.37.84%;P=0.001),特异度无显著差异(80.72% VS 87.14%;P= 0.286)。但BAL标本采集需要对患者实施肺泡灌洗术,操作复杂且患者较痛苦,因此,无创性的血清学检查正成为关注的重点,其中最为广泛应用的是GM和G实验。有报道在血液恶性肿瘤患者中,血清G实验超过界值(80 pg/ml)的IPA患者占74%(22/30),血清GM实验超过界值(ODI>0.5)的患者仅占10%,血清G实验的灵敏度和特异度为90%(95% CI 86-96%)和85%(95% CI 79-86%),血清GM的灵敏度和特异度为30%(95% CI 26-38%)和98%(95% CI 94-100%),对于IPA的诊断,血清G实验优于GM实验[15]。

血清 1,3-β-D-葡聚糖实验是很常见的非侵入性真菌诊断方法,一项纳入16篇文献、2979例患者[确诊和拟诊侵袭性真菌感染(IFI)594例)]的研究发现,G实验诊断IFI的合并灵敏度和特异度分别为76.8%和85.3%[16]。对于确诊或者拟诊的患者,G实验可以在临床诊断前平均10天内出现至少一次阳性,G实验全阴性的阴性预测值为100%,单阳性的特异度为90%；超过2次阳性的G实验结果,其灵敏度和特异度更高[16]。本研究的结果显示,对于单病理阳性的患者,其G实验阳性率仅有14.3%,如果呼吸道标本培养阳性,则G实验的阳性率可达到70%,这可能是病理阳性侵袭性肺曲霉患者的感染灶可能为局限性的曲霉感染或者早期的曲霉定植,其真菌细胞壁产物(1,3-β-D-葡聚糖)未能入血或者含量很少,导致G实验的漏检。而如果呼吸道标本培养阳性,其曲霉感染往往具有侵袭性或者播散性的特征,容易引起机体的免疫应答,从而引起血清中1,3-β-D-葡聚糖的升高。

本研究以确诊或拟诊患者作为研究对象,根据真菌培养和病理检查的结果,分析了G实验在上述不同检查结果中的表现发现,培养和病理检查均阳性的IPA患者,其G实验的阳性率和检测数值均较高,但单病理阳性患者阳性率很低,G实验对这类病人存在漏诊可能,要注意结合培养或者其它实验的结果进行综合诊断。本研究也有不足之处,比如标本量较少,部分曲霉未能进行有效鉴定等,后续的研究中会对未能准确鉴定的菌种,采取多种方法鉴定的方法进行分类,比如质谱鉴定、PCR鉴定等方法。总之,本研究结果还是有助于分析G实验在IPA诊断中的价值。