高效液相色谱-串联质谱法检测血液中甲卡西酮及其代谢物卡西酮

刘冬娴，张旭东，赵明明，贺江南

(1.湖南警察学院刑事科学技术系，湖南 长沙 410138；2.长沙市公安局禁毒支队，湖南 长沙 410000)

甲卡西酮又称“丧尸剂”、“浴盐”、“丧尸药”等，有强烈的兴奋及致幻作用。滥用甲卡西酮会出现幻觉、鼻灼伤、恶心、呕吐等症状，能够造成高度的心理成瘾，属国家管制的第一类精神药品。甲卡西酮进入生物体内产生的主要代谢产物为N位去甲基形成卡西酮[1]。甲卡西酮和卡西酮的化学结构示于图1。

图1 甲卡西酮(a)和卡西酮(b)的结构式Fig.1 Structures of methcathinone (a) and cathinone (b)

在我国山西、广东、黑龙江等地，甲卡西酮滥用的形势严竣[2]，现已成为司法鉴定中常见的分析目标物之一。目前，检测甲卡西酮的方法主要有非生物样品的液相色谱法(LC)[3]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[4-5]及气相色谱-质谱法(GC/MS)[6-7]等，主要对禁毒实践中查获的疑似毒品甲卡西酮进行定性、定量分析。有报道利用GC/MS检测血液[8]、尿液[9-11]中甲卡西酮，其中GC/MS法检测血液中甲卡西酮定量限为0.1 mg/L，未涉及代谢物卡西酮的检测；Sørensen[12]建立了LC-ESI-MS/MS法测定血样中卡西酮、甲卡西酮等10多种毒品成分，检出限分别为1.4、2.0 μg/L；Swortwood等[13]建立了LC-QQQ-MS/MS法检测血清中甲卡西酮及其衍生物，定量限为10 μg/L，线性范围为10～250 μg/L；Zhang等[14]建立了UPLC-MS/MS法检测全血和尿液中安非他命、甲卡西酮等12种毒品成分，采用Oasis MCX柱进行固相萃取，萃取前样品经稀盐酸预处理，上清液过柱，之后依次用稀盐酸、甲醇、氨水洗柱，用5%氨水甲醇溶液洗脱，血液中甲卡西酮、卡西酮的线性范围分别为0.1～10、0.5～50 μg/L。

本研究拟建立HPLC-MS/MS法检测血液中甲卡西酮及其代谢物卡西酮，并应用该方法测定中毒家兔血液中甲卡西酮及卡西酮的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Agilent 1290/6470A HPLC-MS/MS液相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；BSM-3200.2电子天平：上海卓精电子科技有限公司产品。

1.2 材料与试剂

1 g/L甲卡西酮、卡西酮标准储备液：由公安部禁毒局国家毒品实验室提供，使用前用甲醇稀释成所需浓度的标准工作液；盐酸SKF525A(双苯戊二氨酯，纯度95%)：Sigma-Aldrich公司产品，称取11.61 mg盐酸SKF525A(折合10.00 mg SKF525A)溶于10 mL甲醇中，配制成0.1 g/L标准工作液；含50 μg/L内标SKF525A的乙腈溶液的制备：准确吸取125 μL 0.1 g/L SKF525A内标溶液于250 mL容量瓶中，加入50 mL乙腈，混匀，用乙腈定容至刻度，置于4 ℃冰箱冷藏；乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯；空白血液：健康、正常人体近期未服用过药物的新鲜血液；实验用水：去离子纯净水；一次性真空采血管(枸缘酸钠1∶9)：山东省成武县医用制品厂产品；实验家兔(许可证号SCXK(湘)2015-0004)：购于湖南太平生物科技有限公司。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Column Eclipse Plus C18柱(100 mm×3 mm×1.8 μm)；柱温45 ℃；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～3 min(95%～90%A)，3～4 min(90%～40%A)，4～5 min(40%～5%A)，5～9 min(5%～95%A)，9～10 min(95%A)；流速0.3 mL/min；进样量1 μL。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；离子源温度：350 ℃；喷雾电压：3.5 kV；检测方式：多反应监测模式(MRM)；每个化合物分别选择两个离子对作为定性离子对，其定性离子对、定量离子对、碰撞能量和保留时间列于表1。

表1 卡西酮、甲卡西酮和SKF525A的定性离子对、碰撞能量和保留时间Table 1 Qualitative ion pair, collision energy and retention time of cathinone, methcathinone and SKF525A

注：*为定量离子对

1.4 检材处理

取1 mL待检血液于10 mL离心管中，加入2 mL含50 μg/L内标SKF525A的乙腈溶液，涡旋混匀5 min，振荡提取20 min，以8 000 r/min离心15 min，分离上清液，过0.22 μm微孔有机滤膜于1.5 mL样品瓶中,供LC-MS/MS分析，采用内标法-标准曲线法定量分析。

1.5 动物实验

取8只质量为(2.0±0.2) kg的家兔，雌雄不限，分为4组：第1组3只，分别编号T2101、T2102、T2103；第2组1只(空白对照组)，编号T2100；第3组3只，分别编号T2401、T2402、T2403；第4组1只(空白对照组)，编号T2400。按家兔质量，以20 mg/kg剂量，第1组静脉注射10 g/L甲卡西酮氯化钠溶液，第2组静脉注射氯化钠溶液，第3组灌胃10 g/L甲卡西酮氯化钠溶液，第4组灌胃氯化钠溶液。分别于给药后1、2、4、6、8 h采集各组家兔的耳根静脉血，按1.4节方法进行检材处理，按1.3节方法进行LC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 内标物的选择

检测结果的准确性受样品前处理过程及检测方法定量重复性的影响，本研究采用添加内标法消除这些影响，考察了SKF525A作为内标物的提取行为及色谱行为。结果表明，SKF525A提取回收率稳定，血液中添加50 μg/L内标物，其提取回收率可达95.49%(RSD为5.0%，n=6)，与检测目标物提取回收率同步；其色谱保留时间与分析目标物较接近，且对目标物无干扰，故选择SKF525A作为内标物。

2.2 色谱分离

按1.4节方法对空白血液及添加卡西酮(10 g/L)、甲卡西酮(10 g/L)的空白血液进行检材处理，LC-MS/MS法检测，空白血液的总离子流图示于图2，血液添加样品总离子流图及MRM色谱图示于图3。在该实验条件下，卡西酮、甲卡西酮、SKF525A都得到分离，保留时间分别为4.604、5.175、5.735 min，检材中内源性杂质对检测目标物无干扰。

图2 空白血液总离子流图Fig.2 TIC chromatogram of blank blood

2.3 回归方程与线性范围

图3 空白血液添加卡西酮和甲卡西酮的总离子流图(a)及卡西酮(b)、>甲卡西酮(c)、SKF525A(d)的MRM色谱图Fig.3 TIC chromatogram of blank blood added with cathinone and methcathinone (a), MRM chromatograms of cathinone (b),methcathinone (c) and SKF525A (d)

取适量的100.0 mg/L甲卡西酮、卡西酮标准工作液，用甲醇逐级稀释，添加到空白血液中，涡旋5 min，分别配制成含0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 g/L甲卡西酮、卡西酮的血液样品。血液样品按1.4节方法处理，LC-MS/MS法检测，以甲卡西酮、卡西酮与SKF525A色谱峰面积之比为y，以甲卡西酮、卡西酮浓度为x(g/L)进行线性回归。结果表明，甲卡西酮在0.2～2 000 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为y=0.014 1x+0.140 6(r=0.999)；卡西酮在0.5～2 000 μg/L范围内线性关系良好，线性方程为y=0.007 1x-0.023 1(r=0.999)。

分别以3倍和10倍信噪比确定检出限和定量限，甲卡西酮检出限为0.1 μg/L、定量限为0.2 μg/L；卡西酮检出限为0.2 μg/L、定量限为0.5 μg/L，其MRM色谱图示于图4。

2.4 回收率及精密度

取适量的空白血液，按2.3节方法分别配制含0.5、5、50、500 μg/L甲卡西酮、卡西酮的质量控制样品各5份，按照回归方程计算质量控制样品中甲卡西酮、卡西酮的含量，以质控样品中甲卡西酮、卡西酮的浓度与添加甲卡西酮、卡西酮浓度之比计算回收率，对4个浓度的血液样品同日内重复测定6次计算日内精密度，5日内重复测定5次计算日间精密度，结果列于表3。

图4 甲卡西酮(a)、卡西酮(b)的定量限MRM色谱图Fig.4 MRM chromatograms of LOQ of methcathinone (a) and cathinone (b)

表3 添加回收率及精密度Table 3 Recoveries and precision of this method

2.5 家兔血液样品的测定

按1.4节方法和1.3节条件对家兔血液样品进行处理及检测，依据血液样品中甲卡西酮及其代谢物卡西酮含量检测结果分析其代谢规律，结果示于图5。

由图可见，家兔经静脉注射、灌胃方式给药甲卡西酮后，血液中甲卡西酮及其代谢物卡西酮均在1 h达到峰值。静脉注射给药后血液中甲卡西酮峰值远高于灌胃，代谢物卡西酮峰值受给药方式影响不明显，可能是静脉注射甲卡西酮可以直接进入血液循环。静脉注射给药6 h后，血液中甲卡西酮含量降低至峰值的0.0%～1.6%，8 h后低于检出限，卡西酮含量降低至峰值的2.6%～8.3%；灌胃给药8 h后血液中甲卡西酮含量降低至峰值的0.8%～22.5%，卡西酮含量降低至峰值的6.8%～13.7%。静脉注射给药方式血液中甲卡西酮及其代谢物卡西酮消除速率明显高于灌胃给药方式。编号T2403在灌胃给药6 h后，血液中甲卡西酮含量降低至峰值的4.9%，8 h后甲卡西酮含量上升至峰值的22.5%。二次峰值是个体差异所致还是其他原因则有待进一步研究。此外，给药0～1 h后是否存在峰值、8 h后代谢规律如何、给药剂量对代谢规律的影响等问题也有待进一步研究。

注：空白对照组T2100、T2400在1、2、4、6、8 h血液样品中均未检出甲卡西酮及其代谢物卡西酮图5 家兔体内甲卡西酮代谢规律Fig.5 Metabolism rule of methcathinone in rabbits

3 结论

本研究建立了LC-MS/MS法测定血液中甲卡西酮、卡西酮，应用该方法对实验动物血液进行检测，并推测了甲卡西酮的代谢规律。该方法操作简便、检测灵敏度高，可用于血液样品中甲卡西酮、卡西酮的测定。