马铃薯真菌病害拮抗菌株鉴定及初步应用

杨 帆 张飞燕 孙劲冲 刘 双 刘洪伟 张丽萍* 胡 滨

（1 河北工业大学化工学院，天津 300130；2 河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081；3 河北省畜牧站，河北石家庄 071000）

随着马铃薯主粮化战略的实施，我国马铃薯栽培面积持续扩大，由于轮作倒茬困难，土壤中的优势致病菌不断积累（刘高远 等，2014），枯萎病、黑痣病、晚疫病等病害逐年加重，而且常常混合发生，已经成为影响马铃薯品质以及导致马铃薯严重减产的重要因素（王颖 等，2014）。目前马铃薯真菌病害主要以化学防治为主，由于药剂的用量与使用种类逐年增加，造成了病原菌产生耐药性、杀菌剂残留以及环境污染等问题（路粉和王文桥，2017）。采用持续、高效、环保的方法控制病害越来越受到人们的重视，生物防治是解决这些问题的有效途径（Palaniyandi et al.，2013）。目前筛选到的拮抗菌株主要针对1种或2种马铃薯真菌病害，Sharma 等（2015）筛选到1株枯草芽孢杆菌V26，可有效抑制立枯丝核菌在马铃薯根部的定殖，使马铃薯黑痣病的发病率降低；张紊玮等（2018）筛选到假单胞菌YL11对硫色镰刀菌具有较强的拮抗活性；杨继业等（2018）筛选到1株对茄链格孢菌有较强抑制作用的解淀粉芽孢杆菌BAF-6。但是生产应用中往往难以应对多种病害混合发生的情况，筛选抑菌谱宽且对同一种作物多种病原真菌具有较强拮抗作用的生防菌株是今后的研究重点。

河北省科学院生物研究所微生物实验室前期筛选到1株高效广谱的生防菌株BA-26，本试验拟通过形态特征、生理生化特性并结合16S rDNA 同源序列分析对其进行分类鉴定；明确该菌株对马铃薯多种病原菌的抑菌谱及抑菌效果；研究胞外代谢产物特性并验证其对马铃薯的防病促生作用，以期为研制新型生防制剂提供前期工作基础，同时为马铃薯真菌病害的生物防治提供有效的方法。

1 材料与方法

试验于2018年3～11月在河北省科学院生物研究所微生物实验室进行。

1.1 试验材料

1.1.1 菌株BA-26及病原菌来源 菌株BA-26由河北省科学院生物研究所微生物室分离并保藏；马铃薯病原菌名称及来源见表1。

1.1.2 培养基 菌株BA-26的保存和活化均使用PB 培养基，种子培养基为NB 培养基，装液量均为300 mL 三角瓶中装入50 mL。发酵培养基分为NB 培养基和解淀粉优化培养基，装液量均为500 mL 三角瓶中装入100 mL。马铃薯盆栽试验发酵液制备采用芽孢杆菌优化培养基：0.08% 酵母膏，0.1%（NH4）2SO4，0.075% 柠檬酸钠，0.05% KH2PO4，0.03% MgSO4，0.01% MnSO4，玉 米 粉2.6%，蔗糖0.45%，豆饼2.4%，鱼粉0.3%，0.75% CaCO3，去离子水配制，pH 7.3～7.5。试验中所用到的病原真菌均使用PDA 培养基进行培养，菌株BA-26 16S rDNA 序列扩增与分析中菌株的培养使用LB培养基。

1.1.3 菌株BA-26无菌滤液的制备 将斜面保存的BA-26菌株划线接种于种子培养基，置于32 ℃、180 r·min-1摇床培养17 h，以5%的接种量转接于NB 发酵培养基中，摇床设置同上，培养36 h，血球平板计数可知发酵液菌含量约为7.0×108cfu ·mL-1。离心后收集上清液，经0.22 μm 的滤膜过滤后即为无菌滤液，4 ℃保存。

1.1.4 盆栽试验菌株BA-26发酵液的制备 种子培养基培养同1.1.3，以5%的接种量转接于芽孢杆菌优化培养基中，置于32 ℃、180 r·min-1摇床培养48 h，血球平板计数可知发酵液菌含量约为4.0×109cfu·mL-1，显微镜观察确保产生整齐的芽孢。1.1.5供试马铃薯 供试马铃薯品种为费乌瑞它，由河北省春华马铃薯种植有限公司提供。

1.2 菌株鉴定

1.2.1 形态特征及生理生化特征 在PB 平板上接种菌株，32 ℃培养24 h 后观察菌株菌落形态，复红染色后于显微镜下镜检。菌株生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）进行鉴定。

1.2.2 16S rDNA 序列扩增与分析 将BA-26单菌落接种于LB 培养基中，置于32 ℃、180 r·min-1摇床中培养17 h，采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，利用16S rRNA 细菌通用引物27F/1492R 扩增目的片段，PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序，将所得序列与GenBank数据库进行Blast 分析比对，并构建系统发育树。

1.3 室内抑菌活性测定

将90 mL PDA 培养基与10 mL 菌株BA-26无菌滤液混合均匀，制成含无菌滤液培养基平板，每个平板混合培养基的用量为30 mL，在平板中心接入直径为9 mm 的病原菌菌饼，每种病原菌为1个处理，每处理3次重复。以10 mL 无菌水和90 mL PDA 培养基混合为对照，待对照长满平板（平板直径9 mm）后，测量处理组病原菌菌落直径，计算抑菌率（胡忠亮 等，2017）。以立枯丝核菌、燕麦镰刀菌等8种马铃薯病原菌为测试菌株，采用生长速率法测定抑菌率。

抑菌率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/（对照菌落生长直径-菌饼直径）×100%

1.4 BA-26胞外代谢产物特性

1.4.1 热稳定性 将BA-26无菌滤液置于1.5 mL EP 管中，分别在恒温金属浴上60、70、80、90、100 ℃处理30 min，选取1支置于灭菌锅中121 ℃处理30 min，以不做处理为对照，使用平板对峙法测定各处理和对照抑菌直径，以对照的抑菌圈大小为活性100%，计算各处理对茄病镰刀菌的相对抑菌率，每处理3次重复。

1.4.2 酸碱稳定性 用1 mol·L-1的盐酸和1 mol ·L-1的氢氧化钠将BA-26无菌滤液的pH 分别调节为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，以不做处理为对照。室温下放置1 h 后调节pH 为7，测定其对茄病镰刀菌的抑菌活性，每处理3次重复，各处理相对抑菌率计算方法同1.4.1。

1.4.3 紫外照射稳定性 将BA-26无菌滤液置于距离20 W 的紫外灯15 cm 处分别照射2、4、6、8 h，以不做处理为对照，测定其对茄病镰刀菌的抑菌活性，每处理3次重复，各处理相对抑菌率计算方法同1.4.1。

1.4.4 蛋白酶处理稳定性 用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 分别与无菌滤液37 ℃反应1 h，反应浓度均为1 mg·mL-1。以不做处理为对照，测定其对茄病镰刀菌的抑菌活性，每处理3次重复，各处理相对抑菌率计算方法同1.4.1。

1.5 菌株BA-26的防病作用

选取大小一致且无病虫感染的马铃薯块茎清洗干净，用1% NaClO 表面消毒5 min，无菌水冲洗后再用75%乙醇消毒。在无菌操作室将块茎切成厚约1 cm 的薄片，置于BA-26无菌滤液中处理15 min，在薄片表面中心位置接种直径为9 mm 的茄病镰刀菌菌饼，以灭菌的NB 培养液为对照，每处理3次重复。抑制率的计算方法同1.3。

1.6 菌株BA-26的促生作用

试验在河北省科学院生物研究所温室中进行，盆栽种植土以营养土和蛭石1∶1（体积比）混合，121 ℃灭菌3 h，种植盆盆口外径19 cm，深15 cm，每盆种植土用量为400 g。脱毒种薯于人工气候箱催芽至1 cm 左右后在散射光下壮芽，挑选长势一致的种薯切块播种，每盆种1株。试验共设3个处理，播种后在土壤中分别浇灌浓度为4.0×109cfu·mL-1BA-26发酵液10、20、30 mL，每处理30株，2018年10月播种，出苗7 d 时，各处理随机挖取5株调查须根数、须根长；出苗30 d 时，各处理随机挖取5株测定株高、茎粗和叶绿素含量（李芬，2011）。

1.7 数据处理

釆用MEGA 5.0软件对所筛菌株进行系统发育树的构建，采用SPSS 软件对数据进行差异显著性分析，并用GraphPad.Prism.v7.0软件进行图形绘制和统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 菌株BA-26的形态特征 菌株BA-26在PB培养基上生长迅速，早期菌落形态呈白色，表面扁平、光滑，边缘整齐近圆形，生长后期菌落不透明，开始向中间聚拢并呈火山状凸起，边缘不规则呈褶皱状态（图1），菌体呈杆状，长约2.3 μm，宽约0.7 μm（图2），革兰氏染色阳性，芽孢中生，呈椭圆形。

2.1.2 菌株BA-26的生理生化特性 对菌株BA-26进行生理生化特性鉴定（表2），初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus）。

2.1.3 菌株BA-26的分子生物学鉴定 菌株BA-26的16S rDNA 序列长度为532 bp（图3），尚未在NCBI 备案，通过BLAST 软件与GenBank数据库进行同源性比对，选取具有较高同源性的模式菌株，通过MEGA 软件采用邻位连接法构建系统发育树（图4），可见菌株BA-26与Bacillus amyloliquefaciens strainMd1-43高度相近，结合形态特征将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图1 BA-26的菌落形态

图2 BA-26的菌体形态

表2 菌株BA-26的生理生化指标

2.2 菌株BA-26的抑菌谱测定

从表3和图5可以看出，菌株BA-26的无菌滤液对茄链格孢菌、立枯丝核菌等8种马铃薯病原真菌均有较强抑制作用，其中对茄链格孢菌、燕麦镰刀菌、茄病镰刀菌的抑菌率均达80%以上；对接骨木镰刀菌和三线镰刀菌的抑菌率均在68%以上。可见BA-26能有效抑制多种马铃薯病原真菌，具有防治多种马铃薯真菌病害混合发生的潜力。

图3 菌株BA-26的16S rDNA 序列

图4 菌株BA-26的16S rDNA 系统发育树

2.3 菌株BA-26胞外代谢产物性质

2.3.1 热稳定性 菌株代谢产物的热稳定性会影响生防菌剂的加工及其田间效果的发挥。如图6所示，菌株BA-26无菌滤液经100 ℃处理30 min，对茄病镰刀菌的相对抑菌率保持在90%以上。经121 ℃处理30 min 后，相对抑菌率仍维持在70%以上，可见其代谢产物具有较强的热稳定性。

2.3.2 酸碱稳定性 如图7所示，菌株BA-26胞外代谢产物在pH 为2～10的环境中处理1 h 后，对茄病镰刀菌的相对抑菌率均在80%以上。pH 为11时，相对抑菌率开始下降至50%左右。表明菌株BA-26代谢产物具有较强的酸碱稳定性，在实际生产与应用中可适应的酸碱范围较广。

表3 BA-26无菌滤液对病原菌的抑菌率

图5 BA-26无菌滤液的抑菌效果

图6 菌株BA-26的热稳定性

图7 菌株BA-26的酸碱稳定性

图8 菌株BA-26的紫外照射稳定性

2.3.3 紫外照射稳定性 如图8所示，在试验照射时间范围内，随着紫外照射时间的延长，代谢产物的稳定性缓慢下降，照射8 h 后对茄病镰刀菌的相对抑菌率仍达85%，表明其具有较强的紫外照射稳定性。

2.3.4 蛋白酶处理稳定性 菌株BA-26胞外代谢产物经1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶37 ℃处理1 h 后，相对抑菌率分别为89.2%、89.2%和93.5%，说明BA-26胞外代谢产物对蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，具有较强的蛋白酶稳定性，可能含有肽类或脂肽类等物质。

2.4 菌株BA-26的防病作用

如图9所示，BA-26无菌滤液可显著抑制茄病镰刀菌病斑的扩散。对照病斑从薯块中心位置向四周蔓延并呈水渍状浸染，中心部位向内凹陷表明病原菌已经侵入马铃薯内部。接种第5天，病斑平均直径为3.2 cm；而BA-26无菌滤液处理的病原菌纵向和横向的侵染均受到明显抑制，菌落平均直径1.1 cm，对马铃薯茄病镰刀菌的抑制率为91.3%，可有效预防茄病镰刀菌对马铃薯块茎的侵染。

2.5 菌株BA-26的促生长作用

盆栽试验结果表明（图10、表4），不同用量的BA-26发酵液对马铃薯植株的根系有明显促生作用。施用10、20、30 mL 发酵液处理后，马铃薯根长分别比对照增加了7.03%、32.07%、21.89%，其中20 mL 和30 mL 处理较对照差异显著；须根数分别比对照显著增加73.97%、111.94%、83.98%。

图9 BA-26离体防病试验结果

图10 BA-26对马铃薯根系的影响

表4 BA-26发酵液对马铃薯根系生长的影响

从表4还可以看出，20 mL BA-26发酵液处理对马铃薯株高和叶绿素含量均具有显著促进作用，分别较对照增加了48.0%和19.6%；不同用量的BA-26发酵液对马铃薯茎粗影响不显著。

3 结论与讨论

真菌病害严重制约着马铃薯产业的发展，生防微生物对环境友好、可诱导相关防御酶提高植物的抗病能力、减少土壤中致病菌的积累，是解决这一问题的重要生防资源。现有生防菌株多对1种或2种马铃薯真菌病害有较好的防效，存在生防能力单一、应用范围窄等问题，往往无法应对马铃薯真菌病害混合发生的情况，亟须筛选鉴定高效广谱抗马铃薯真菌病害的生防菌株。芽孢杆菌由于可以产生抗逆芽孢、代谢产物抗菌物质丰富、降解农药残留（宋胜男 等，2018），是一类具有较大应用价值的生防菌株，王颖等（2014）发现死谷芽孢杆菌263XY1对马铃薯贮藏期坏疽病菌、炭疽病菌和枯萎病菌具有较强的拮抗作用；畅涛等（2014）发现芽孢杆菌ZA1对马铃薯炭疽病菌、褐腐病菌和干腐病菌具有较强的抑制作用，本试验鉴定出1株对马铃薯黑痣病菌、干腐病菌、早疫病菌等8种病原真菌具有较强拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌。该菌株对马铃薯真菌病害抑菌谱更宽，对贮藏期和苗期的主要马铃薯真菌病害均表现出较强的拮抗活性。

生防菌主要通过代谢产物防治植物病害，因此代谢产物稳定性研究对于以其为核心的生物制剂的生产和田间应用具有重要的意义，周国旺等（2015）研究发现苏云金芽孢杆菌BtLTS290经121℃处理后仍有抑菌活性，在pH 3～11、蛋白酶K 处理后活性基本不变；胡忠亮等（2017）研究发现解淀粉芽孢杆菌HZM9代谢产物经100 ℃处理30 min 后，抑菌率下降到66.55%，pH 5～9的酸碱处理稳定性强，紫外照射和蛋白酶处理稳定性强。本试验中，菌株BA-26代谢产物对紫外照射和蛋白酶处理不敏感，与以上研究结果相似，经pH 2～10的酸碱处理和121 ℃加热30 min 后，抑菌率分别保持在80%和70%以上，较上述菌株热稳定性和酸碱稳定性更强，可见BA-26分泌的抗菌物质能更好地适应特殊的生境，应用范围更广。

芽孢杆菌还可通过分泌生长激素、溶磷作用、产铁载体等机制促进植物的生长。崔文艳等（2018）研究发现解淀粉芽孢杆菌Y2发酵液可使玉米株高、根长、叶宽、鲜质量和干质量分别增加28.29%、27.21%、18.56%、80.93%、66.67%；邢芳芳等（2016）研究表明枯草芽孢杆菌PSM 菌剂可使普通白菜叶绿素和可食用叶片数分别较空白对照增加5.13%和25.86%。本试验发现，每盆施 用20 mL 浓 度为4.0×109cfu·mL-1的BA-26发酵液使马铃薯根长、须根数、株高分别显著增加32.07%、111.94%、48.0%，植株能更好地抵抗病原菌的侵染，应对不利环境的胁迫。同时，叶片中叶绿素含量显著提高19.6%，叶片中叶绿素含量是植株健康的重要表征指标，与植物抗病性有直接的关系（顾振芳 等，2004）。

本试验明确了菌株BA-26作为马铃薯专用生防菌剂的巨大潜力及进一步开发应用的价值，对后续植物真菌病害生防菌株的筛选、鉴定及研究具有重要的指导意义。