光核桃仁与桃仁HPLC 指纹图谱比较

杜 欢，徐 僮，李 琪，王 张，张 静∗，范 刚∗

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都611137）

桃仁为常用中药材，来源于蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟种子［1］，具有活血祛瘀、润肠通便的功效，常用于治疗闭经、痛经、跌打损伤、肠燥便秘等。光核桃仁为光核桃Amygdalus mira（Koehne）Yu et Lu.的干燥成熟种子［2］，藏文音译为“康布”，产于西藏、四川、云南等地，常生于海拔2 000～4 000 m 的山坡杂木林中或山谷沟边。现代研究表明［3-6］，光核桃仁中含有苦杏仁苷、β-谷甾醇、反式角鲨烯、生育酚、维生素E、油酸、棕榈酸等成分。此外，现代药理学研究发现［7-8］光核桃仁具有一定的扩张血管及抗炎作用，且安全性良好。

光核桃仁曾收载于1987年版《四川省中药材标准》 增补本中［9］，而现行2010年版《四川省中药材标准》［10］与2015年版《中国药典》 桃仁药材项下并未收载光核桃仁Amygdalus mira。然而，据《常见中药材品种整理与质量研究》 中桃仁类专题研究结果［11］及本课题组调查发现，药材市场上存在有大量光核桃仁作为桃仁药材流通和使用。目前，光核桃仁与桃仁样品是否能等同使用仍然缺乏科学依据。因此，采用准确、客观的方法研究桃仁与光核桃仁药材的化学成分差异对于二者的品种鉴定及其能否等同使用评价具有重要的意义。

HPLC 指纹图谱是从中药多组分、多靶点出发的现代分析技术，现已成为国内外中药品种鉴定及质量评控的常用方法［12-16］。目前，已有学者开展了桃仁药材的指纹图谱研究及质量标准研究［17-19］，但尚未见与光核桃仁药材HPLC 指纹图谱比较研究的文献报道。本研究拟建立光核桃仁药材HPLC 指纹图谱，并结合偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）二者的化学成分差异，以期为2种桃仁的鉴定和区别提供参考依据，促进桃仁药材的合理利用与开发。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，配备二极管阵列（DAD）检测器、自动进样器和柱温箱（美国Agilent 公司）；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；Sartorius BP121 s 电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；ULUP-I-10T 优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；CQ-250超声波清洗器（上海必能信有限公司）；TDZ5-WS 台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。苦杏仁苷购自成都瑞芬斯生物科技有限公司（批号K-001-161216，含有量＞98%）。甲醇、乙醇均为分析纯；乙腈、磷酸为色谱纯；实验用水为超纯水。本研究共采集13批光核桃仁药材，经成都中医药大学王张副研究员鉴定为蔷薇科植物光核桃Amygdalus mira（Koehne）Yu et Lu.的干燥成熟种子。此外，本研究收集了11批桃仁药材，参考《常见中药材品种整理与质量研究》 中桃仁专项研究结果［11］，根据药材性状鉴定为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch（TR-2、TR-3和TR-5）或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.（TR-1、TR-4、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10和TR-11）的干燥成熟种子。信息见表1。

表1 光核桃仁和桃仁样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Inertsil C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，程序（0～5 min，5%～8% B；5～20 min，8%～9% B；20～30 min，9%～15% B；30～40 min，15%～20% B；40～60 min，20%～27% B）；检测波长210 nm；柱温25 ℃；体积流量1.0 mL／min；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加乙腈配制成0.120 mg／mL 的对照品溶液，作为参照物溶液，储存在4 ℃的冰箱中，备用。

2.3 供试品溶液制备 取本品粗粉约2.0 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，加30%乙醇溶液20 mL，加热回流30 min，放冷，称定质量，用30%乙醇溶液补足减失质量，摇匀，离心处理（4 000 r／min，10 min）。取上清液10 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批次（GHTR-12），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样5次，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于0.06%；共有峰相对峰面积RSD 小于2.6%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批次（GHTR-12），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、2、4、8、12 h 进样，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于0.11%，共有峰相对峰面积RSD 小于2.8%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批次（GHTR-12）样品5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1.1%，共有峰相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 HPLC 指纹图谱建立及分析

2.5.1 HPLC 指纹图谱建立 取不同批次的光核桃仁及桃仁药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样。13批光核桃仁药材HPLC 指纹图谱中有12个共有峰。由于苦杏仁苷在各批次光核桃仁中均有出现，分离度良好，且峰面积较大，故选择苦杏仁苷（9号峰）作为参照峰。见图1。

图1 光核桃仁与桃仁HPLC 指纹图谱

2.5.2 相似度分析 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”系统评价软件，分别导入13批光核桃仁、11批桃仁样品指纹图谱的AIA 数据文件，设置多点校正，采用中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为1.0，自动匹配，生成对照指纹图谱，以特征指纹图谱共有模式为对照，计算各批次样品的相似度。结果，光核桃仁各批次样品的相似度为0.922～0.996；桃仁各批次样品的相似度为0.904～0.997，见表2。

表2 各样品相似度

2.5.3 HPLC 指纹图谱比较 通过直观比较，发现光核桃仁与桃仁样品HPLC 指纹图谱大体相似，二者均具有12个共有峰，但部分化学成分的峰面积存在较大的差异，如共有峰9、10、11和12，其中11号与12号峰差异最为明显。

2.5.3.1 偏最小二乘法判别分析 为了研究光核桃仁与桃仁样品的化学成分差异，将二者12个共有峰的峰面积数据导入SIMCA-P 软件进行偏最小二乘法判别分析（PLSDA），根据PLS-DA 得分图和载荷图观察2个品种的区别，并找出引起差异的主要成分。先采用中心化方法对原始峰面积数据进行尺度同一化处理，再进行PLS-DA 分析。结果PLS-DA 模型参数为R2X=80.4%、R2Y=87.5%，Q2=70.0%，可见模型拟合良好。图2表明，PLS-DA 模型能够很好的区分光核桃仁与桃仁样品，同时也表明2种桃仁样品的化学成分具有明显差异。此外，根据载荷图，见图3，可知，9、11、12号峰为引起差异的最主要化学成分，对分类的影响最大，其中9号峰根据对照品对照鉴定为D-苦杏仁苷。

图2 桃仁与光核桃仁样品PLS-DA 得分图

图3 桃仁与光核桃仁样品PLS-DA 载荷图

2.5.3.2 差异成分显著性分析 利用PLS-DA 多变量分析方法，能够从多维数据中寻找出贡献于分类的主要差异成分。然而，并不能判断观察到的差异是否具有统计学意义。因此，有必要采用统计分析方法进一步确证差异的显著性。本研究采用SPSS 21.0分析软件对PLS-DA 分析发现的差异成分（9、11、12号峰）进行t检验。结果9号峰（P=0.02＜0.05）、11号峰（P=0.00＜0.01）和12号峰（P=0.00＜0.01）在2种桃仁药材之间均具有显著性差异，其中9号峰为D-苦杏仁苷。

3 讨论

3.1 样品制备方法的优化 本研究分别对样品提取方法、溶剂等进行考察，采用冷浸、超声和回流提取方法，结果发现冷浸提取的效率最低，而超声提取的效率最高。然而，由于光核桃仁与桃仁样品中均存在苷类成分酶解的情况［17］，如果采用超声提取的方式，会导致药材中化学成分发生改变。课题组在预实验过程中发现光核桃仁的10、11、12号峰均不稳定，其峰面积会不断变化，影响指纹图谱的建立。因此，本研究最终选择回流提取方法，以高温破坏酶的活性，杀酶保苷。此外，本研究还考察了提取溶剂，包括石油醚、乙酸乙酯、不同浓度的甲醇、乙醇和水，最终发现30%乙醇的提取效果最佳。

3.2 色谱条件优化 本研究比较了Inertsil C18柱、InertSustain C18柱及WondaSil C18柱的分离效果，结果以Inertsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱的分离效果最佳；考察样品在210、254、280 nm 等不同波长下的吸收情况，结果以210 nm 波长处吸收最佳；考察了3个不同柱温条件（20、25、30 ℃），发现样品的色谱图基本类似，无较大区别，故柱温选择出峰时间适中的25 ℃。此外，考察了甲醇-纯水、甲醇-0.2% 磷酸、乙腈-纯水、乙腈-0.2% 磷酸等不同流动相对化学成分分离效果的影响，最终选择乙腈-0.2%磷酸为流动相。

3.3 结果分析 本研究首次建立了光核桃仁HPLC 指纹图谱，指定了12个共有峰。根据云琦等［17］的研究报道，苦杏仁苷存在旋光异构，在桃仁药材中常存在L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷2种构型。根据对照品对照结果及文献报道，光核桃仁HPLC 指纹图谱中8号峰鉴定为L-苦杏仁苷，9号峰鉴定为D-苦杏仁苷。其中，D-苦杏仁苷在药材中的含有量较高，L-苦杏仁苷含有量较低。此外，根据相关文献报道［3-4］，课题组对光核桃仁药材中是否含有β-谷甾醇、生育酚和维生素E 进行研究，结果仅测定出β-谷甾醇，但含有量很低，故未作为共有峰，而生育酚和维生素E 并未检测出。

3.4 比较分析 本研究所建立的HPLC 指纹图谱及PLSDA 分析方法，能够很好的区分光核桃仁与桃仁，为市场上2种桃仁药材的鉴别提供了参考方法。HPLC 指纹图谱比较可知，光核桃仁与桃仁样品的化学成分大体相似，均具有12个共有峰，表明2种桃仁药材在市场上混合使用有一定的依据。然而，根据PLS-DA 及t检验分析结果，可知2种桃仁药材中的3种化学成分（9、11、12号峰）含有量有明显差异。因此，光核桃仁作为桃仁药材使用仍需慎重，这3种成分的含有量差异是否会导致药材的有效性和安全性不同，值得进一步研究。此外，经过对照品对照，HPLC指纹图谱中9号峰鉴定为D-苦杏仁苷，但11、12号峰目前无法指认，课题组下一步将采用GC-MS、HPLC-MS 等技术进一步鉴定这2种差异成分。