黄芩苷通过IκBα／NF-κB 通路调节Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡

周 伟，庾国桢，刘亚敏，涂 淮，沈 强∗

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州510405；2.东莞市中医院，广东 东莞523106；3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510405；4.广东省中医院，广东 广州510006）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病，阿尔茨海默病的标志性病理特征是脑部组织的老年斑中有大量的β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积，Aβ 沉积引起的神经毒性在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用［1］。Aβ25-35是Aβ 引起神经毒性的主要种类之一，可引起大鼠的记忆力下降和脑内炎症的产生，研究表明由Aβ25-35诱导产生的促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α 引起神经元凋亡，与阿尔茨海默病的发病具有密切的关系［2］。而研究发现阿尔茨海默病患者的脑内神经元出现了大量的凋亡，神经元凋亡是导致阿尔茨海默病病人神经元丢失的主要机制，减少神经元凋亡可能成为治疗阿尔茨海默病新的方法［3-4］。另外，NF-κB 参与炎性反应、免疫反应和细胞凋亡等生物过程，证据表明Aβ25-35可以激活NF-κB，并且在阿尔茨海默病患者的脑部组织老年斑块附近的神经元和神经胶质细胞核中检测到活化的NF-κB［5］。NF-κB 与IκBα 以无活性形式相互结合在细胞质中，一旦被特定因素，如Aβ25-35刺激，IκBα 将被磷酸化并降解，从而引起NF-κB 激活，并导致IL-1β、TNF-α 等炎症因子过度分泌，造成神经元细胞凋亡，引起神经系统功能减退，促进阿尔茨海默病病程的进展［6］。临床研究表明，阿尔茨海默病患者的脑部组织具有慢性炎性反应的特征，而且在阿尔茨海默病患者的脑部组织内存在过量的炎性因子如IL-1β和TNF-α 等［7-8］，另有研究表明使用非甾体抗炎药的中年男性的患阿尔茨海默病风险显著降低，而且可以延缓阿尔茨海默病患者的病程［9］。因此，通过抑制Aβ25-35激活的IκBα／NF-κB 通路减少炎症性毒性引起的神经元凋亡可能为治疗阿尔茨海默病为提供了新的途径。

黄芩苷是黄芩中有效的黄酮类化合物之一，已被广泛用于治疗各种炎症性疾病，研究表明黄芩苷通过抗炎作用发挥抗凋亡，从而起到保护神经元的作用，说明黄芩苷有可能成为阿尔茨海默病的新治疗药物［10］。研究证实黄芩苷可穿透血脑屏障分散于脑部组织，更多的聚集在海马、皮质和丘脑等部位，并且能改善痴呆模型鼠的学习能力及认知功能［11］。但黄芩苷是否能通过IκBα／NF-κB 通路减少Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡未见明确报导。本研究以HT22细胞作为细胞模型，HT22细胞是永生化小鼠海马细胞系，与分化后的原代海马神经元功能相似。多奈哌齐在临床上被用于治疗阿尔茨海默病，具有神经保护和抗炎作用，为本研究的阳性对照药物［12］。

1 材料

1.1 试药 盐酸多奈哌齐（含有量≥99%）（上海源叶生物科技有限公司，批号B25489）；黄芩苷（含有量≥98%）（上海源叶生物科技有限公司，批号S30647）；DMEM、FBS、胰蛋白酶（美 国 Gibco 公 司，批号分别为C11996500BT、SLF10270106500、25200072）；蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（上海贝博生物公司，批号分别为BB31211、BB3401）；Annexin V-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒（中国联科生物公司，批号70AP101100）；PBS 缓冲液（中国博士德公司，批号AR0192）；Aβ25-35、MTT、DMSO（美国Sigma 公司，批号分别为R003143、M5655、D2650）；盐酸多奈哌齐、β-actin、p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，批号分别为4967S、2859、13346、12703、11948）。

1.2 仪器 QQ-80 A-II CO2细胞培养箱（上海启前电子科技有限公司）；BBS-SDC 超净工作台（上海博科集团）；FC500流式细胞仪（美国贝克曼公司）；CKX31／41／IX51奥林巴斯倒置显微成像系统（北京仪器仪表有限公司）；Image Quant LAS 4000成像系统（美国GE Healthcare公司）。

1.3 细胞株 HT22细胞由中山大学孙逸仙纪念医院实验中心提供，HT22细胞在补充有10% FBS 的DMEM 中，于含有5% CO2，37 ℃的培养箱中生长，细胞2～3 d 传代1次。

2 方法

2.1 药物制备 使用双蒸水中制备Aβ25-35（200 μmol／L）的贮备溶液，并在37 ℃下孵育1周诱导肽聚集后避光储存在-20 ℃；使用双蒸水制备多奈哌齐（10 mmol／L）储备溶液，储存于常温；使用DMSO 制备黄芩苷（1 mmol／L）贮备溶液，避光储存在-4 ℃。

2.2 分组、给药 HT22细胞分为空白组、模型组、黄芩苷组、多奈哌齐组。空白组在含有10%血清的培养基培养24 h；模型组加入Aβ25-35（40 μmol／L）培养24 h［13］；按照文献提示，黄芩苷组加入黄芩苷（50 μmol／L）预处理1 h 后，加入Aβ25-35（40 μmol／L）共同作用24 h［10］；多奈哌齐组加入多奈哌齐（20 μmol／L）预处理1 h 后，加入Aβ25-35（40 μmol／L）共同培养24 h［12］。

2.3 MTT 测定及细胞形态学观察 通过MTT 法测定黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞增值率的影响。将HT22细胞以2.5×103／孔的密度接种于96孔板中培养，当达到70%～80%融合时，按照上述细胞分组与药物处理细胞，每组细胞设置6个复孔。培养24 h 后，各个细胞孔加入20 μL 的MTT（5 mg／mL），继续温育4 h，用150 μL 的DMSO 替换每孔含MTT 的培养基，并在摇床上震荡10 min。在酶标仪490 nm 处读取OD 值，细胞存活率=（OD实验组／OD空白组）×100%。并在倒置显微镜下观察各组细胞的形态与数量的变化。

2.4 Annexin V-FITF／PI 检测 通过流式细胞术测定黄芩苷拮抗Aβ25-35诱导的细胞凋亡的效果。将HT22细胞以8×104／孔的密度接种于6孔板中培养，细胞过夜贴壁后，按照上述细胞分组与药物处理细胞。培养24 h 后收获细胞，按照试剂盒说明书以1×106个细胞的密度重悬于500 μL 的5×Binding Buffer 缓冲液，每管加入5 μL Annexin V-FITC 或10 μL PI，避光孵育5 min，用Beckman Coulter FC500流式细胞仪分析细胞的凋亡率。

2.5 Western blot 分析黄芩苷对IκBα／NF-κB 通路及其下游炎性因子的影响。将HT22细胞以10×104／孔的密度接种于6孔板。细胞过夜贴壁后，按照上述细胞分组与药物处理细胞，培养24 h 后收集细胞。冰冷的PBS 洗涤细胞3次后用含有1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞30 min，使用BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。使用12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳对各组蛋白进行分离，随后将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜，并在室温下用5%BSA 封闭1 h。将聚偏二氟乙烯膜与一抗于4 ℃温育过夜（β-actin，1 ∶2 000；p-IκBα，1 ∶2 000；p-NF-κB，1 ∶500；IL-1β，1 ∶1 000；TNF-α，1 ∶4 000）。次日将聚偏二氟乙烯膜与二抗（1 ∶2 000）孵育1 h。最后使用Image Quant LAS 4000成像系统使蛋白条带显像，并获得灰度值，蛋白相对灰度值=实验组灰度值／空白组灰度值。

2.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以（）表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD 法，P＜0.05差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞形态的影响 与空白组比较，模型组的细胞密度明显降低，细胞间的间隙增大，细胞形态被破坏，细胞碎片较多；与模型组比较，黄芩苷组与多奈哌齐组的细胞密度明显增高，细胞间的间隙较小，细胞形态较完整，细胞碎片较少；黄芩苷组细胞密度较多奈哌齐组的稍高、细胞间隙比较小、细胞形态较完整，见图1。

3.2 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞存活率的影响 见表1。与空白组比较，模型组的细胞存活率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷组和多奈哌齐组的细胞存活率明显升高（P＜0.01）；与黄芩苷组比较，多奈哌齐组的细胞存活率较低（P＜0.01），说明50 μmol／L 的黄芩苷作用24 h 可拮抗Aβ25-35引起的细胞毒性。

3.3 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡的影响 与空白组比较，Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡聚集在右下象限为早期凋亡，模型组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄芩苷组与多奈哌齐组的细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）；与黄芩苷组比较，多奈哌齐组的细胞凋亡率较高（P＜0.05）。说明黄芩苷通过抗凋亡作用，起到拮抗Aβ25-35诱导的细胞毒性的作用。见图2、表2。

图1 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞形态的影响（×40）

表1 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞存活率的影响（， n=6）

表1 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞存活率的影响（， n=6）

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与黄芩苷组比较，▲▲P＜0.01

图2 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡的影响

表2 黄芩苷对Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡率的影响

3.4 黄芩苷对IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子的影响与空白组比较，模型组p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNFα 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷组、多奈哌齐组p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋白表达水平显著较低（P＜0.01）；与黄芩苷组比较，多奈哌齐组p-IκBα、p-NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋 白表达 较高（P＜0.05，P＜0.01）。黄芩苷和多奈哌齐可以通过降低由Aβ25-35激活的IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子TNF-α、IL-1β 的分泌来抑制炎性反应。见图3、表3。

表3 黄芩苷对IκBα／NF-κB 通路和其下游炎性因子的影响

4 讨论

阿尔茨海默病是一种好发于中老年人的神经退行性疾病，给社会健康及社会经济带来了沉重的负担。阿尔茨海默病的病理特征表现为局部细胞和分子的炎症性改变，例如由Aβ 组成的神经炎斑块，以及由高磷酸化的Tau 蛋白组成的神经原纤维缠结，但阿尔茨海默病的更重要的触发因素是异常折叠的Aβ 的毒性积累，主要由小胶质细胞Aβ清除受损引起，这种清除Aβ 斑块的失败诱发了神经炎症和神经退行性反应，对阿尔茨海默病的病程进展具有重要的促进作用［14］。Aβ25-35是Aβ 的一种具有神经毒性的亚型，与本研究结果相一致的是，Aβ25-35作用于HTT22细胞24 h后，镜下观察细胞形态明显受损，细胞数量明显减少，细胞活力测定进一步确定Aβ25-35对细胞造成了明显的细胞毒性，使细胞增值率明显降低。而通过黄芩苷预处理后，细胞的形态得到了明显的改善，细胞增值率明显升高，且其保护细胞的作用与多奈哌齐相比，更具有优势。说明黄芩苷可拮抗由Aβ25-35引起的细胞毒性。

细胞通过坏死与凋亡2种方式死亡，细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，是1种在正常发育和组织稳态中起关键作用的生物学过程。阿尔茨海默病是进行性的神经退变性疾病，而海马神经元突触的改变和海马神经元的凋亡直接导致患者记忆下降和认知障碍，且有证据表明阿尔茨海默病患者的脑部组织发现了过量的凋亡的神经元，提示阿尔茨海默病患者可能是通过细胞凋亡的方式丢失神经元，从而引起认知功能减退，另外，Aβ25-35刺激产生的炎性反应可导致细胞凋亡，说明通过干预Aβ25-35引起的神经元凋亡有助于改善阿尔茨海默病的病程［3-4，15］。本研究表明，Aβ25-35可引起HT22细胞的早期凋亡，这可能是Aβ25-35引起细胞增值率降低的方式。而黄芩苷可明显降低细胞的凋亡率，从而发挥拮抗Aβ25-35的细胞毒性，起到保护神经元的作用，且黄芩苷抗凋亡的效果较多奈哌齐强。

慢性的神经炎症是促进神经衰老变性和促进凋亡的最重要机制，减轻神经炎症可能成为预防和治疗阿尔茨海默病的策略。NF-κB 是1种关键的与炎症有关的转录因子，可通过调节下游炎症相关因子来促进炎症发展和进展，NFκB 由哺乳动物细胞中的5个家族成员组成，包括p50、p52、p65、c-Rel 和RelB，其中最常见的NF-κB 形式是p65和p50的异二聚体［16］。研究表明，在Aβ 沉积的神经元和退行性的神经元检测到高活性的NF-κB 和IκBα，在Aβ 中的神经元中斑块周围地区也可检测到较高水平的NF-κB 和IκBα，且NF-κB 的过度表达可刺激Aβ 过度沉积，这都说明NF-κB 的激活和过表达都对阿尔茨海默病的病程的进展具有重要的作用［17］。在大多数细胞类型中，p65和p50的异二聚体通常以与IκBα 以相对静止的状态存在于细胞质的线粒体中，一旦IκBα 响应一些特定的刺激而被磷酸化，NF-κB 将被激活，从而开始靶基因的转录，产生炎性因子IL-1β、TNF-α 等［18］。已经证明过表达IL-1β、TNF-α 的转基因动物表现出认知障碍，而抑制IκBα／NF-κB 通路的激活从而减少IL-1β、TNF-α 等炎性因子的分泌可改善阿尔茨海默病模型鼠的认知障碍，且阿尔茨海默病患者中IL-1β、TNF-α 的水平高于正常人，而且IL-1β、TNF-α 都可以刺激Aβ 的产生［18-19］。研究证实Aβ25-35诱导的炎症反应导致神经细胞凋亡和突触损失，此外，炎症反应加速Aβ 的沉积，形成恶性循环，加速阿尔茨海默病的进展［20］。在本研究中，我们证明了Aβ25-35刺激HT22细胞后，促进了IκBα 与NF-κB 的磷酸化，刺激了IL-1β、TNF-α 的过度表达，表明Aβ25-35可以激活IκBα／ NF-κB 通路，引起下游炎症因子IL-1β、TNF-α 的产生，从而诱发炎性反应，引起了细胞凋亡，导致细胞增殖率的下降。而黄芩苷可以抑制IκBα 与NF-κB的磷酸化，和抑制IL-1β、TNF-α 的表达，从而拮抗Aβ25-35引起的炎症性细胞毒性，减少了细胞凋亡，提高了细胞的增值率，且黄芩苷抑制IκBα／NF-κB 通路的能力优于经典药物多奈哌齐。

阿尔茨海默病属于中医痴呆范畴，其病因复杂，毒损脑络的病因病机逐渐得到重视。脑为清灵之府，当气血津液运行失常时，痰浊、瘀血停于体内，相互交阻化毒为害，损伤脏腑经络，使脑窍壅塞，神机失用而诱发阿尔茨海默病［21］。中医病机中的毒损脑络与Aβ25-35诱导的炎性反应介导的细胞毒性有着共通之处，黄芩具有清热解毒的功效，在临床上被广泛应用，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用，但是黄芩成分繁杂，作用机制难以明确，所以分析黄芩中的单体成分为开发新药物更具有优势［22］。黄芩苷为黄芩最主要的成分之一，研究表明，清开灵的主要成分含有黄芩苷，清开灵可改善阿尔茨海默病模型鼠的认知障碍，且研究亦证实单用黄芩苷可改善可抑制阿尔茨海默病模型大鼠的认知功能障碍，还可拮抗Aβ1-42的细胞毒性，提高SHSY5Y 细胞的生存率［22-23］。黄芩苷还可诱导神经元的分化和抑制环磷腺苷效应元件结合蛋白的表达，说明黄芩苷的神经保护作用越来越得到重视［24］。本研究表明黄芩苷通过抑制HT22细胞中IκBα／ NF-κB 通路，减少IL-1β、TNF-α的分泌，从而减少Aβ25-35诱导的细胞凋亡，使细胞增值率升高，且黄芩苷保护细胞的作用优于多奈哌齐。Aβ25-35诱导的炎性反应越来越成为影响神经元损伤的1个因素，进一步探讨黄芩苷的保护作用机制可能会为治疗阿尔茨海默病寻找到新的药物。