3种竹叶抗氧化有效成分分析

郭 静，王浩然，沈周媛，张 彤，袁秀荣，丁 越∗

（1.上海中医药大学，上海201203；2.徐州市夏桥社区卫生服务中心，江苏 徐州221011）

我国竹类资源丰富，是世界上最主要的产竹国，目前已收载了原产及少数引进的竹亚科植物43属707种、52变种及98变型［1］，其中《中国中药资源志要》 上列出了30余种药用竹种，包括常见的禾本科淡竹叶属植物淡竹叶Lophatherum gracileBrongn.、大明竹属植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.、刚竹属植物淡竹（又名毛金竹）Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等［2-3］，其中淡竹叶的茎叶称淡竹叶，苦竹的叶称苦竹叶，而淡竹等的叶则被统称为竹叶，在我国拥有极其悠久的药用和食用历史。淡竹叶主要分布于长江以南各省区，有清热泻火、除烦利尿的功效，经炮制干燥后使用，主治热病烦渴、口疮尿赤、热淋涩痛等症。其小块根亦作药用。苦竹叶分布于江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、四川等地，具有清心解毒、利尿明目之功效，以嫩叶入药，常用于热病烦渴、失眠、小便短赤、口疮、目痛、失音、烫火伤。竹叶主要分布于山东、河南及长江流域以南各地，具有清热除烦、生津利尿之功效，随时采鲜品入药，多用于治疗热病烦渴、小儿惊痫、咳逆吐衄、小便短赤、口糜舌疮。其笋可供食用，中药之“竹茹”“竹沥”一般取自本种。

近年来，由于竹叶保健作用明显、安全性高，常被开发成色、香、味俱佳的保健产品，如竹叶酒、竹叶茶等，具有提高机体免疫力、抑菌杀菌、清除氧自由基等功效［4］。竹叶中含有大量的黄酮、酚酸、多糖、氨基酸及微量元素等，其中以黄酮和酚酸居多，是竹叶的主要活性物质［5-7］。竹叶中黄酮类多属于黄酮碳苷和黄酮氧苷，主要有苜蓿素、日当药黄素、木犀草素、木犀草苷、异荭草苷、荭草苷等；酚酸类主要包括香豆酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等［8-13］。现代药理研究证明，竹叶具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗肿瘤、降血脂等作用［14-21］，其中黄酮、酚酸类表现出较强的药理活性，具有显著的抗氧化活性。目前以竹叶黄酮、内酯和酚酸类为主的竹叶抗氧化剂（AOB）已列入国标GB-2760，被卫生部批准作为天然食品抗氧化剂使用，在北美和亚洲等地区已安全应用于食品、保健品、医药、化妆品的开发［22-24］，具有广阔发展前景。

竹叶具有显著的抗氧化活性，市场应用极为广泛。但是，由于竹叶品种繁多、性状相近、功效相似、成分复杂，目前尚无系统有效的鉴别方法，即便是纳入《中国药典》 的淡竹叶也缺少成分含有量测定的质量控制标准［25-26］，更缺乏对其抗氧化活性的物质基础研究。本研究采用DPPH 法、ABTS 法及FRAP 法对其活性成分进行抗氧化活性研究，根据其适用性、稳定性与可重复性优选出DPPH 法用于3种竹叶提取物的抗氧化活性评价，再通过指标成分含有量与提取物抗氧化活性的相关与回归分析，初步探讨3种竹叶中的抗氧化活性物质基础，以期为竹叶资源的合理利用和健康产品的有效开发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 series 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；JA31002电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；DHG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；XS105DU 电子天平（梅特勒-托利多中国）；JP-300B 高速多功能粉碎机（浙江永廉市久品工贸有限公司）；SB5200D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；微孔板分光光度计（美国Bio Tek 公司）。

1.2 药物和试剂 1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（美国Sigma 公司）；L-抗坏血酸（国药集团化学试剂有限公司）；维生素E 类似物（上海碧云天生物技术有限公司）；绿原酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素对照品（上海源叶生物科技有限公司）。FRAP 法总抗氧化能力检测试剂盒、ABTS 快速法总抗氧化能力检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）。

实验中所用3种竹叶经上海中医药大学宋龙博士鉴定为禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracileBrongn.的干燥叶及根茎、禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.的干燥叶、禾本科植物淡 竹Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等的干燥叶。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 分别取绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素对照品约5 mg，精密称定，甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得到约0.5 g／L 的对照品溶液，同法配制约1 g／L 的异荭草苷、荭草苷、异牡荆素对照品溶液。分别精密量取绿原酸1 mL、异荭草苷2.5 mL、荭草苷2 mL、异牡荆素2 mL、木犀草苷0.2 mL、木犀草素0.2 mL、芹菜素0.1 mL，混合后加50%甲醇定容至10 mL，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 HPLC 待测样品 取各竹叶粉末（过65目筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇25 mL，室温超声提取30 min，冷却至室温，10 000 r／min 离 心10 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 抗氧化活性待测样品 待测提取液的前处理方法同HPLC 待测样品的制备，所得提取液还需经适当浓缩或稀释配制成系列质量浓度待测液。另取绿原酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素对照品及L-抗坏血酸、维生素E 类似物阳性抗氧化物各约1 mg，精密称定，分别加适量DMSO 溶解，配制成20 mmol／L 的对照品溶液，再分别加50%甲醇稀释成系列浓度的成分待测液。

2.2 7种成分含有量测定 按2015年版《中国药典》 中药质量标准研究制定要求，结合预试验中成分含有量、分离度、专属性等考察结果，最终确定以绿原酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素作为竹叶测定指标，并建立了一种可用于3种竹叶中7种成分含有量测定方法。色谱条件，Diamonsil Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，10% B；2～30 min，10%～30% B；30～45 min，30%～70%B；45～55 min，70% B；55～60 min，70%～10%B）；体积流量1.0 mL／min；检测波长350 nm；进样量10 μL。每个样品平行测定3次。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 各成分对DPPH 自由基的清除活性 新鲜配制6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分别加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同浓度的成分待测液10 μL 加入，摇匀后加入甲醇140 μL，于室温避光反应1 h，在517 nm 处测定吸光度为A样品；未加待测液的的空白DPPH 溶液（10 μL 甲醇）的吸光度为A空白。每份样品各平行测定3次，取平均值。样品对DPPH 的清除率可表示为

采用SPSS v21.0软件，以成分浓度和相应的清除率计算其IC50，单位mmol／L。

2.3.2 各成分对ABTS 自由基的清除活性 根据ABTS 试剂盒说明书配制ABTS 工作液，稀释过氧化氢和过氧化物酶溶液，以维生素E 类似物为标准品配制系列浓度溶液，构建标准曲线。96孔板中先加入20 μL 过氧化物酶工作液，再加入10 μL各成分待测液和ABTS 工作液170 μL 轻轻混匀，室温孵育6 min 后测定414 nm 处吸光度，根据标准曲线计算待测成分的抗氧化值。

2.3.3 各成分对铁离子的还原能力 按照FRAP试剂盒说明书配制适量的FRAP 工作液，并以FeSO4·7H2O 为标准品配制系列浓度溶液，构建标准曲线。96孔板中先加入180 μL FRAP 工作液，再加入5 μL 各成分待测液混匀，37 ℃孵育3～5 min后测定593 nm 处吸光度，根据标准曲线计算其抗氧化值。

2.3.4 各竹叶提取物对DPPH 自由基的清除活性 新鲜配制浓度为6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分别加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同浓度的待测提取液10 μL 加入，摇匀后加入甲醇140 μL 于室温避光反应1 h，在517 nm 处测定吸光度并按上述公式计算待测提取液对DPPH自由基的清除率，并采用SPSS 21.0软件计算其IC50，单位mg／mL。

3 结果

3.1 不同竹叶中7种成分的含有量测定及抗氧化活性测定

3.1.1 线性关系考察 取“2.1.1”项下混合对照品溶液加50% 甲醇逐次稀释2倍，注入HPLC 测定，以色谱峰峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归。结果见表1。7种成分及其在不同竹叶样品中的高效液相色谱图见图1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various components

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various components

3.1.2 不同竹叶中7种成分的含有量及其抗氧化活性 分别测定了7批淡竹叶、10批苦竹叶和9批竹叶提取物及7种成分的抗氧化活性，结果见表2～3，结果均表示为（）。不同竹叶提取物清除DPPH 自由基的IC50均值比较结果如图2。其结果表明竹叶提取物的抗氧化活性最强，苦竹叶次之，淡竹叶最弱，竹叶和苦竹叶清除DPPH 自由基的能力约为淡竹叶的2～3倍，且淡竹叶的抗氧化活性与竹叶、苦竹叶比较均具有显著的统计学差异（P＜0.05）。

图2 3种竹叶提取物清除DPPH 自由基的能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of the extracts from three kinds of bamboo leaves

3.2 双变量相关性分析

3.2.1 双变量相关性分析 采用双变量相关性分析分别对3个品种竹叶中7种成分的含有量与对应品种提取物的抗氧化活性的相关性进行了分析，分析结果见表2所示。其结果表明，芹菜素含有量与淡竹叶提取物抗氧化活性呈显著正相关（P＜0.05），绿原酸、异荭草苷含有量与苦竹叶提取物抗氧化活性呈极显著正相关（P＜0.01）；荭草苷含有量与竹叶提取物抗氧化活性呈极显著正相关（P＜0.01），即绿原酸、异荭草苷、荭草苷和芹菜素含有量与3种竹叶提取物抗氧化活性具有显著的相关性（P＜0.05）。但由于提取物活性通常是各成分总体作用的结果，仅通过相关性不能直观的根据各成分的含有量预测样品的抗氧化活性，还需进一步回归分析。

表2 各成分的抗氧化活性及相关性分析结果Tab.2 Results of antioxidant activities of various components and correlation analysis

3.2.2 逐步回归分析 利用SPSS v21.0统计软件对成分含有量数据及提取物清除DPPH 自由基的抗氧化活性进行逐步回归分析（“Entry”=“0.15”，“Removal”=“0.20”）［27-28］，结果显示，淡竹叶中荭草苷、芹菜素含有量与其提取物清除DPPH 自由基的能力呈极显著正相关（P＜0.01）；苦竹叶中异荭草苷含有量与其提取物清除DPPH 自由基的能力呈极显著正相关（P＜0.01）；竹叶中荭草苷含有量与其提取物清除DPPH 自由基的能力呈极显著正相关（P＜0.01）。综合前述回归分析与相关性分析结果，初步确定淡竹叶、苦竹叶、竹叶提取物中的主要抗氧化活性成分，其中淡竹叶抗氧化活性主要与芹菜素相关；苦竹叶抗氧化活性主要与异荭草苷相关；而竹叶抗氧化活性主要与荭草苷相关。此外，本研究还对各指标成分含有量、含有量之和共8个自变量与因变量提取物抗氧化值（IC50）进行了回归分析，初步得到了不同品种竹叶抗氧化活性与各成分含有量的回归方程，见表4，其中A表示提取物清除DPPH 自由基活性，Cn表示相应成分的含有量。将各成分含有量数据代入表中的回归方程进行抗氧化活性的预测和模拟，见图3。结果表明，所观测的抗氧化活性值与实测的抗氧化活性值趋势基本一致，均呈正相关，且淡竹叶回归方程预测效果最好（R=0.984），有望经过后续进一步的试验验证，应用于淡竹叶抗氧化活性的快速推测。

表3 各成分含有量测定结果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

表3 各成分含有量测定结果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

注：-表示未检测出。IC50表示清除50%DPPH 自由基时所对应的提取物浓度

表4 成分含有量与提取物抗氧化IC50值的逐步回归结果Tab.4 Results of stepwise regression analysis between content of components and antioxidant IC50values of extracts

图3 回归方程模拟结果Fig.3 The simulation results of regression equations

4 讨论

研究中常用的抗氧化活性评价方法为DPPH自由基清除法，ABTS 自由基清除法，铁离子还原能力（FRAP）法及羟自由基清除法等［29-31］。本研究分别以ABTS 法、DPPH 法和FRAP 法考察了3种竹叶7种成分的抗氧化活性，其中ABTS 法测定结果表明绿原酸抗氧化能力最强，而芹菜素最弱；DPPH 法结果表明异荭草苷抗氧化活性最强而芹菜素最弱；FRAP 法结果表明木犀草素抗氧化活性最强而芹菜素最弱。3种方法测定结果均表明7种成分中以芹菜素抗氧化活性最弱，但对其中成分较强的化合物的抗氧化活性测定结果不尽相同，可能与3种测定方法的工作机理、测试环境、待测物在测试溶剂中的溶化性等相关。经实验研究及结果分析发现，FRAP 法中以FeSO4·7H2O 为对照品，其反应体系主要为水，而黄酮类难溶于水，在水环境下会析出沉淀，影响实验测定结果，故FRAP 法不适用于竹叶提取液中黄酮类的抗氧化活性测定；ABTS 法测定过程中需要使用过氧化物酶，而过氧化物酶属蛋白质类，易受到有机试剂的影响而失活。本研究在预试验中采用ABTS 法测定提取物的抗氧化活性时，结果较不稳定，重复性差，故ABTS 法不适合作为本实验中提取物的抗氧化活性评价方法；而DPPH 法中的DPPH 本身是种很稳定的氮中心的自由基，易溶于甲醇、乙醇，其体系弹性更大，能更好的使竹叶中的主要成分充分发挥清除自由基的作用，且DPPH 法稳定性好，可重复性强，数据准确、可靠。因此，本研究最终选用了DPPH 法。

近年来，学者们提出了中药谱效学的研究思路，并在采用数据分析技术预测成分药效、阐明各成分对药效贡献率、寻找主要活性成分方面取得了一定的进展［32］。本研究采用双变量相关分析与多元回归分析2种常用方法将样品中7种成分含有量与3种竹叶提取物抗氧化活性相关联，找出其中与活性密切相关的变量，初步阐明了其药效物质基础，并通过回归方程对样品的抗氧化活性进行了模拟，基本与实测结果趋势保持一致，有望通过该方程的进一步验证，快速推测竹叶样品的抗氧化活性，为3种竹叶原药材的快速筛选与健康产品的合理开发提供参考。