二丁颗粒HPLC 指纹图谱建立及5种成分测定

2019-11-21梁梓敏覃洁萍郭海姣

中成药 2019年11期

梁梓敏，覃洁萍，郭海姣

（广西中医药大学药学院，广西南宁530001）

二丁颗粒为2015年版《中国药典》收载的中药成方制剂，由紫花地丁、半边莲、蒲公英、板蓝根4味药材组成，功效清热解毒，用于火热毒盛所致的热疖痈毒、咽喉肿痛、风热火眼［1］，可治疗痤疮、慢性支气管炎、急性咽炎等［2-7］。目前，药典中二丁颗粒质量控制指标仅为秦皮乙素［1］；近来有学者报道了其中单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、菊苣酸3种成分含有量的测定方法［8］，但仍未能对制剂整体质量进行有效评价，如表告依春为板蓝根主要有效成分，具有很强的抗病毒活性［9-10］，但目前并无相关报道。

单咖啡酰基酒石酸、咖啡酸、菊苣酸等酚酸类成分具有抑病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等药理作用［11-12］，秦皮乙素具有抗炎、抗肿瘤作用［13-15］，为二丁颗粒药效成分。因此，本实验建立二丁颗粒HPLC 指纹图谱，并测定表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸含有量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配置UV 型紫外检测器、安捷伦工作站（美国安捷伦公司）；密思博超纯水器；SQP 电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200B 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS-26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药紫花地丁（批号20180501）、板蓝根（批号20180101）、蒲公英（批号20180201）、半边莲（批号20180201）均由南宁市景昌中药饮片有限公司提供，经广西中医药大学鉴定教研室蔡毅教授鉴定为正品。表告依春（批号171206）、单咖啡酰基酒石（批号171130）、菊苣酸（批号171130）对照品（上海融禾医药科技有限公司）；秦皮乙素（批号110741-200102）、咖啡酸（批号110885-201708）对照品（中国食品药品检定研究院），含有量均大于98%。二丁颗粒共10批，批号171193（20 g／袋），购自四川古蔺肝苏药业有限公司；批号 180120（20 g／袋）、180401（20 g／袋）、181410D（20 g／袋）、180604D（无糖，4 g／袋）、180317（20 g／袋），购自修正药业集团长春高新制药有限公司；批号180911（无糖，4 g／袋）、180918（无糖，4 g／袋）、180903（20 g／袋）、180926（20 g／袋），由广西中医药大学药学中心实验室制备。

甲醇、乙腈为色谱纯；乙醇等其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4.0 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，5%～10% A；12～20 min，10% A；20～30 min，10%～17%A；30～50 min，17%～24% A）；体积流量1.0 mL／min；检测波长242 nm（0～12 min）、330 nm（12～50 min）；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，置于5个10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，制得贮备液，取适量置于同一量瓶中，甲醇稀释，制成分别含表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸10.8、60.4、111、11.1、28.0 μg／mL，即得。

2.2.2 供试品溶液精密称取相当于原药材2～5 g的颗粒适量，置于100 mL 具塞锥形瓶中，加入40 mL 60%乙醇回流45 min，滤过，滤液挥干，残渣用60%乙醇溶解并定容至10 mL，13 000 r／min离心，取上清液过微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按处方工艺制备缺紫花地丁、板蓝根、蒲公英、半边莲的其他药材各1份，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 HPLC 指纹图谱

2.3.1 稳定性试验取颗粒（批号180926）2.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定。以4号峰（秦皮乙素）保留时间和色谱峰面积为参照，测得其余10个色谱峰相对保留时间RSD 在0.03%～0.17%之间，相对峰面积RSD在0.27%～2.8%之间，表明溶液在24 h 内稳定性良好，符合指纹图谱测定要求。

2.3.2 精密度试验取供试品溶液（批号180926），在“2.1”项色谱条件下进样测定6次。以4号峰（秦皮乙素）保留时间和色谱峰面积为参照，测得其余10个色谱峰相对保留时间RSD 在0.05%～0.29%之间，相对峰面积RSD 在0.37%～2.0%之间，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定要求。

2.3.3 重复性试验取同一批颗粒（批号180926）2.5 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定。以4号峰（秦皮乙素）保留时间和色谱峰面积为参照，测得其余10个峰相对保留时间RSD 在0.02%～0.13% 之间，相对峰面积RSD在0.30%～1.6% 之间，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定要求。

2.3.4 建立方法取10批颗粒适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1，再采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723版）对指纹图谱进行分析，发现11个共有峰（图2），其中4号峰为秦皮乙素，是君药紫花地丁主要活性成分，该色谱峰分离度较好，响应值较高，保留时间适宜，故选择其为参照峰。相似度见表1，可知各批样品相似度均在0.90以上，表明指标成分一致性较好。

图1 10批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

图2 HPLC 指纹图谱共有峰Fig.2 Common peaks of HPLC fingerprints

表1 10批样品相似度Tab.2 Similarities of ten batches of samples

2.3.5 特征峰归属精密吸取表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，二极管阵列检测器同时记录色谱图和各色谱峰紫外吸收光谱，并与指纹图谱共有模式中共有特征峰进行对比，发现共有模式中2～5、9号特征峰的保留时间及其紫外光谱分别与表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸对照品一致，故确认为相应成分。然后，精密吸取缺紫花地丁、蒲公英、半边莲、板蓝根阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，并与颗粒指纹图谱共有模式中共有特征峰进行比对，结果见图3，可知1、8号峰为4种药材共有特征峰，2号峰（表告依春）归属为板蓝根，4号峰（秦皮乙素）、7号峰归属为紫花地丁，3号峰（单咖啡酰基酒石酸）、5号峰（咖啡酸）、9号峰（菊苣酸）归属为蒲公英，6、10～11号峰归属为半边莲。

图3 二丁颗粒及阴性样品HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of Erding Granules and negative samples

2.4 含有量测定

2.4.1 专属性试验取供试品、对照品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由图可知，对照品、供试品色谱图相应位置具有相同保留时间色谱峰，阴性无干扰，理论塔板数以秦皮乙素（3号峰）计应不少于6 000。

2.4.2 线性关系考察取对照品贮备液适量，逐级稀释制成分别含表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸2.16～86.2、12.1～133、22.1～244、2.22～24.4、5.60～61.6 μg／mL 的溶液，各精密吸取5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图4 各成分HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度试验精密吸取对照品溶液5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样6次，测得表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸峰面积RSD 分别为0.77%、1.0%、0.97%、1.1%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液（批号180926），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL，测得表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸峰面积RSD 分别为 0.39%、0.44%、0.34%、0.60%、0.82%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验精密称取同一批样品（批号180926）6份，每份2.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL，测得表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸含有量RSD 分别为1.2%、1.6%、1.2%、1.5%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验精密称取各成分含有量已知的样品（批号180926）1.25 g，共6份，精密加入含表告依春（0.040 4 mg／mL）、单咖啡酰基酒石酸（0.401 mg／mL）、秦皮乙素（0.686 mg／mL）、咖啡酸（0.066 6 mg／mL）、菊苣酸（0.269 mg／mL）对照品溶液各1.00 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样5 μL测定，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4.7 样品含有量测定精密称取相当于原药材2～5 g 的不同批号颗粒粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL 测定，计算含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g， n=2）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=2）

3 讨论

3.1 色谱条件选择本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.08%磷酸、乙腈-0.12%磷酸流动相，发现乙腈-0.1%磷酸洗脱时各成分色谱峰分离度较好，而且出峰时间适中；考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18（250 mm ×4.6 mm，4.0 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm × 250 mm，5.0 μm）、Phenomenex Gemini-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，发现Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱分离度、峰形、柱效较好；考察了柱温25、30、35 ℃，发现30 ℃时分离度、峰形较好；考察了体积流量0.8、1.0、1.2 mL／min，发现1.0 mL／min 时洗脱效果较好；采用DAD 检测器在190～400 nm 波长处进行扫描，发现表告依春、单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸最佳吸收波长分别为242、330、344、322、330 nm，为了使各成分均能获得尽可能高的测量灵敏度，本实验采用双波长切换时间序列采样方式进行检测，即0～12 min 242 nm，12～50 min 330 nm，发现在此条件下各成分吸收及峰型较理想，并可达到良好的分离效果。综上所述，最优色谱条件为Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4.0 μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱；体积流量1.0 mL／min；检测波长242、330 nm；柱温30 ℃。

3.2 提取条件选择本实验考察了甲醇、30%甲醇、60% 甲醇、水、乙醇、30% 乙醇、60% 乙醇、40%甲醇（含1% 乙酸）［12］、70% 甲醇（含5% 甲酸）［16］，发现以60%乙醇为提取溶剂时各成分综合提取率最高；考察了冷浸、超声、回流提取，发现回流提取效率明显优于超声提取与冷浸提取；考察了25、40、55 mL 提取溶剂体积及15、30、45、60、90 min 提取时间，发现40 mL、45 min 时各成分基本提取完全。综上所述，最优提取条件为40 mL 60%乙醇回流提取45 min。