左旋丁基苯酞灌胃联合高压氧治疗后缺氧缺血性脑损伤小鼠脑组织Nogo-66、NgR、NFP表达观察

张洋，王显鹤

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯 154002)

缺氧缺血性脑损伤(HIBI)是一种脑部损伤，新生儿HIBI是常见的脑病之一，羊水异常等多种因素都有可能导致分娩时新生儿的HIBI[1]。勿动蛋白-66(Nogo-66)通过与勿动蛋白-66受体(NgR)的结合抑制了中枢神经系统轴突再生，损伤了脑的神经功能，使NgR具有着检测脑神经系统功能是否正常的作用[2,3]。神经丝蛋白(NFP)是神经轴突的主要细胞骨架，主要作用是维持轴突的正常形态和功能，是检测神经系统轴突损伤情况的指标[4,5]。研究[6]表明，左旋丁基苯酞能有效降低缺氧缺血神经细胞的凋亡率，而高压氧舱治疗可有效提高脑组织的血氧含量，使神经元细胞的结构和功能得到修复，这为HIBI的治疗提供了新思路。本研究对HIBI小鼠采用左旋丁基苯酞灌胃及高压氧舱治疗，观察小鼠脑组织Nogo-66、NgR、NFP表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级的新生11 d的KM小鼠80只，雌雄不限，体质量6.97～7.45(7.21±0.24)g。采购于昆明医科大学实验动物中心。所有小鼠进行标准饲养，自由进食，充足光照。

1.2 主要试剂及仪器 左旋丁基苯酞(纯度99%)，使用前需要植物油稀释，稀释10倍后配置溶剂。sABC试剂盒，DAB显色试剂盒。大型高压氧舱，免疫荧光分析仪动物饲料，手术器械，麻醉药品。

1.3 HIBI模型制备及左旋丁基苯酞灌胃和高压氧舱治疗方法 选取80只小鼠，并随机分为观察组及对照组各40只。两组小鼠均吸入乙醚后麻醉，以仰卧姿势固定在手术台上，切开颈部皮肤，结扎左侧颈总动脉并缝合切口，2 h后置于5 000 mL密闭有机玻璃箱中。通入含有8%的氧气的氮氧混合气体，2 h后恢复正常供氧，制成HIBI模型。观察组小鼠灌胃左旋丁基苯酞10 mg，后放入高压氧舱治疗，高压氧舱治疗需要每日早上9点将小鼠放入动物高压氧实验舱，使用纯氧加压到0.18 MPa(1.8ATA)，再慢慢减压，用纯氧洗舱3次后，加压到0.25 MPa(2.5ATA)，吸氧60 min，经20 min匀速减压出舱，1次/d。对照组小鼠在制模成功后不进行特殊处理。

1.4 小鼠脑组织Nogo-66、NgR检测方法 在制模后第1、3、5、7、10天每组分别取8只小鼠，采用注射10%水合氯醛将小鼠过量麻醉后，使用室温生理盐水和4 ℃的4%的多聚甲醛进行心脏灌流。完成后打开小鼠的颅腔并取出大脑，选用薄刀片切下1 mm左右的脑组织，操作后将脑组织切片放到3%的戊二醛溶液中进行固定。取出脑组织后用磷酸盐缓慢冲洗3次，冲洗结束后将脑组织切片放入四氧化锇固定2 h；脱水后使用包埋剂进行包埋聚合，并且运用硝酸铅与醋酸铀染色后制成切片。在普通显微镜下观察切片，利用荧光显微镜成像摄片，根据免疫组织荧光组织化学显示，观察神经元上Nogo-66及NgR绿色荧光面积及表达水平，使用ImageJ软件将结果量化。结果以积分光密度(IOD)表示，IOD值越高表明绿色荧光面积越大，Nogo-66及NgR表达水平越高。

1.5 小鼠脑组织NFP检测方法 采用链霉亲和素-过氧化物酶复合物法对小鼠脑组织标本进行NFP免疫组化染色。选取小鼠脑室旁白质部位进行10×40视野摄片，用医学图像分析系统分析图片，用IOD值表示阳性染色程度。结果以IOD值表示，IOD值越高表示阳性染色程度越高，说明表达阳性NFP神经元数较多。

2 结果

2.1 两组不同时点Nogo-66、NgR IOD值比较 不同时点Nogo-66、NgR IOD值比较见表1。

表1 两组不同时点Nogo-66、NgR IOD值比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组NFP表达比较 观察组及对照组NFP IOD值分别为316.794±16.389、161.032±17.084，两组比较，P<0.05。

3 讨论

HIBI是一种脑部损伤，窒息、羊水异常等多种因素都有可能导致分娩时新生儿的HIBI，临床表现为惊厥、呼吸不规则、尖叫、拒乳等[7,8]，该病是新生儿期常见疾病及易致死致残性疾病，部分患者可能遗留不同程度的神经系统损害症状，如脑瘫、智力低下、癫痫、自闭症等。目前治疗手段除了维持良好通气、有效控制惊厥及减轻脑水肿外，同时还可应用亚低温、高压氧等治疗方法，重组人类红细胞生成素以及干细胞治疗处于临床试验阶段。如何有效治疗及减轻HIBI带来的不良后遗症，该问题成为一直困扰临床医务工作者及科学家难题，为此有关HIBI的研究，不论在临床上还是动物实验方面，开展相关研究非常多，而尝试采用左旋丁基苯酞联合高压氧舱治疗方法的相关研究非常少，所以相关研究和分析是十分必要的[9,10]。

目前，左旋丁基苯酞治疗法可以明显改变神经元生长状态，降低了Nogo-66和NFP的表达水平[11]。高压氧舱治疗法已经被广泛地应用到了脑外伤的治疗中，为未来的研究和分析提供了科学的借鉴[12,13]。因为左旋丁基苯酞联合高压氧舱治疗的方法加强了对神经元中Nogo-66和NgR表达的抑制作用，促进了神经元的自身恢复和功能正常，所以在未来将有更加广泛的应用，为脑外伤的治疗打下了良好的基础。

研究发现，Nogo-66这一具有抑制活性的结构，许多研究者认为Nogo-66的存在使Nogo蛋白具有神经抑制活性的作用，使得Nogo-66成为表达神经功能是否正常的指标[14,15]。NgR是Nogo-66的一种功能性细胞表面受体，与Nogo-66结合以抑制细胞活性，损伤了中枢神经系统的功能，在研究中可以利用NgR来表达脑神经的状态[16]。NFP是构成神经通讯网络的基本结构，在传递内外信息、运输物质及转换能量等方面有着重要作用[17,18]。正是因为Nogo-66、NgR和NFP的表达水平反映了神经元功能的状况，所以研究Nogo-66、NgR和NFP对分析神经系统的发病机制、临床治疗等有着重要意义。观察组小鼠Nogo-66以及NgR表达明显低于对照组，原因在于左旋丁基苯酞联合高压氧舱治疗方法抑制了Nogo-66和NgR的表达。在治疗后观察组小鼠的Nogo-667和NgR表达水平明显降低，左旋丁基苯酞和高压氧舱的治疗方式降低了神经细胞的凋亡率，使得小鼠脑内水肿减少，促进了小鼠脑内神经功能的恢复[19,20]。另外，观察组NFP阳性表达增多且神经元数量较多，IOD值提高同时阳性染色程度增高，主要原因是左旋丁基苯酞联合高压氧舱治疗方式抑制了神经细胞的凋亡，促进NFP发挥传递信号和表达信息的作用，使得NFP活性明显提高，从而表现为IOD值显著升高且阳性染色程度有所提高。

总之，左旋丁基苯酞灌胃联合高压氧治疗后缺氧缺血性脑损伤小鼠脑组织Nogo-66、NgR表达下降，NFP表达升高。