大黄素灌胃对原发性高血压大鼠心脏功能的改善作用及其机制

周广海，岳华，吴博，金松南，文今福

(山东第一医科大学，山东泰安 271000)

高血压是指以体循环动脉血压升高为主要特征，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征，是临床常见病、多发病。虽然抗高血压的药物不断问世，然而并没有有效地控制其发生发展趋势，目前全球发生率仍呈现居高不下的态势，患病率高达31.1%[1]。长期的高血压可导致心肌肥厚、心律失常、心功能不全等心脏功能紊乱。因此，高血压治疗目的不仅仅在于控制血压，更重要的是对其靶器官的保护。2016年9月～2018年7月，我们通过给原发性高血压(SHR)大鼠灌胃大黄素，观察大黄素对SHR大鼠心脏功能的改善作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 大黄素购自西安嘉天生物科技有限公司，抗B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体和抗Bcl-2相关的X蛋白(Bax)抗体购自Cell Signaling Technology，抗含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)抗体购自Santa Cruz，反转录和qPCR试剂购自北京全式金生物，PCR引物由上海生工合成。BL-420S型生物机能实验系统(四川泰盟科技)，Western blot设备(君意)，Rotor-Gene Q实时定量PCR仪(Qiagen)。

1.2 实验动物、分组及大黄素灌胃 SHR(收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg)大鼠10只，WKY大鼠5只，均为雄性，8～10周龄，体质量200～230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物的使用遵守山东第一医科大学实验动物伦理委员会要求。10只SHR大鼠分为A、B组各5只，5只WKY大鼠设定为C组，A组每天灌胃30 mg/kg的大黄素，其余两组灌胃大黄素溶剂—1%羧甲基纤维素钠溶液，维持10周。

1.3 大鼠血流动力学相关指标观察 大鼠灌胃10周后，停药1 d，腹腔注射1 g/kg乌拉坦麻醉，做颈动脉插管，连接压力换能器，利用BL-420S型生物机能实验系统记录动脉血压(SBP、DBP)，然后插入左心室，5 min后读取左心室功能指标(HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax)。结束后处死大鼠，并留取心脏和肾脏，冻存于-80 ℃环境备用。

1.4 心脏组织ANP、BNP、NPR-A、NPR-B及肾脏组织NPR-A、NPR-B、NPR-C检测 采用荧光定量PCR法。心脏和肾脏中总RNA提取参照试剂盒说明书操作，在反转录酶的作用下反转录成cDNA。ANP上游引物：5′-ATACAGTGCGGTGTCCAACAC-3′，下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCAAGAG-3′；BNP上游引物：5′-GCTTTGGGCAGAAGATAGACCG-3′，下游引物：5′-AGAAGAGCCGCAGGCAGAG-3′；NPR-A上游引物：5′-GGAAACGCATTGAGTTGACA-3′，下游引物：5′-TGGTGAGCGAGTACCGAAA-3′；NPR-B上游引物：5′-CTCTATGCCAAGAAGCTGTGG-3′，下游引物：5′-CCAGGCCTTCCAAGTAGAAAG-3′；NPR-C上游引物：5′-GGTGACACCATTCGGAGAATC-3′，下游引物：5′-AGCTTGCTTAGCTTCAAAGTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAACG-3′，下游引物：5′-GTGGTTCACACCCATCACAAAC-3′。qPCR反应体系中分别加入cDNA模板、目的基因和内参基因的上下游引物、SYBR Green混合溶液和水，总体积为20 μL/管，用实时定量PCR仪实时监测荧光强度，以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.5 心脏组织bcl-2、bax、ARC蛋白检测 采用Western blotting法。取出心脏，按照每10 mg组织后加入100 μL组织裂解液，匀浆，冰上裂解，离心后收集上清，加入上样缓冲液，煮沸10 min，-80 ℃保存备用。样品以20 μg/孔上样，电泳并转膜后，脱脂奶粉室温封闭2 h，分别用anti-bcl-2、anti-bax、anti-ARC一抗孵育过夜，TBST洗膜后相应二抗室温孵育1 h，ECL显影，通过上海欧翔科学仪器有限公司的化学发光成像系统扫描，使用Image-Pro Plus软件进行分析条带，以平均光密度OD值×面积表示蛋白含量，将目的蛋白与内参比值作为目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 各组血流动力学相关指标比较 血流动力学相关指标比较见表1。

2.2 各组心脏组织ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及肾脏组织NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表达比较 心脏组织ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及肾脏组织NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表达比较见表2。

表1 各组血流动力学相关指标比较

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

表2 各组心脏组织ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及肾脏组织NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表达比较

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

2.3 各组心脏组织bcl-2、bax、ARC蛋白表达比较 心脏组织bcl-2、bax、ARC蛋白表达比较见表3。

表3 各组心脏组织bcl-2、bax、ARC蛋白表达比较

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

3 讨论

高血压是临床常见疾病，以体循环动脉压升高为主要表现，伴或不伴有多种心血管危险因素，90%以上的高血压患者属SHR。高血压与冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的发生密切相关，严重威胁人类身体健康。长期的高血压可导致心脏功能紊乱，如心肌肥厚、心律失常、心功能不全等。目前，临床上常用的降压药主要有利尿药、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂等五大类。此外，中医药在治疗高血压方面也积累了大量经验，特别是在治疗轻中度高血压以及部分重度高血压方面优势显著，不仅能改善症状，提高生活质量，还能稳定血压，平稳降压，缓和降压，改善危险因素，保护靶器官，使部分患者达到停药减量目的[2]。中药有效成分如葛根素、白藜芦醇、丹参酮、原花青素等对于治疗高血压病心血管重塑、缓解临床症状及降低并发症上确有疗效[3]。

大黄素是从大黄、虎杖和何首乌等廖科中药材中分离得到的游离型蒽醌类化合物，其药理作用广泛，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用，也具有一定的利尿和降压作用，对疾病的治疗作用日益受到国内外的重视。研究显示，大黄素能抑制高糖引起的血管内皮细胞毒性[4]，抑制高脂饲料诱导的动脉粥样硬化的形成[5]，降低大鼠离体胸主动脉的紧张性，使血管扩张[6]。大黄素在大鼠心脏中的作用也有报道，如大黄素减弱自身免疫性心肌炎[7]，抑制肾性高血压所致的心肌重塑[8]，或抑制糖尿病心肌病[9]。

血流动力学指标HR代表心率，心率越快，心输出量越大，血压越高；动脉收缩压SBP和动脉舒张压DBP反映外周血压的高低，高血压时二者经常同时升高；左心室收缩压LVSP、左心室舒张末压LVEDP和左心室内压最大上升和下降速率±dp/dtmax是反映心肌舒缩性能的可靠指标，其中LVSP、+dp/dtmax反映心脏收缩功能，正值越大，收缩性能越强，而LVEDP、-dp/dtmax反映心脏舒张功能，负值越大，舒张性能越好。高血压引起心脏负荷增加，心肌代偿性肥厚，心肌舒缩功能增强，LVSP、LVEDP和±dp/dtmax指标数值变大，当心脏失代偿即心功能不全后，舒缩功能减弱。本实验中，SHR大鼠的HR、SBP、DBP、LVSP和±dp/dtmax都明显高于对照大鼠，而大黄素灌胃10周后SHR大鼠HR、±dp/dtmax都显著降低，提示大黄素能明显降低高血压大鼠的心率，改善左心室舒缩功能，防止心力衰竭的发生。本实验中我们观察到大黄素能改善SHR大鼠左心室舒缩功能，这与孔倩倩等[10]报道大黄素改善缺血/再灌注心脏左心室舒缩功能、Wu等[11]报道大黄素抑制急性心肌梗死相符合。这些提示大黄素在心血管功能紊乱中发挥保护作用。

钠尿肽(NPs)家族中，ANP和BNP为主要的心脏循环激素[12,13]，可促进钠尿排泄，扩张血管，抑制血管升压素和肾素—血管紧张素—醛固酮系统，抗心肌纤维化，进而产生降低血压、保护心血管的作用。我们前期研究[14]发现，大黄素呈浓度依赖性地促进离体心房分泌ANP，提示大黄素可能具有保护心血管系统的作用。本研究显示，SHR大鼠心肌ANP、BNP mRNA表达增加，这与Jin等[15]报道的结果一致，而大黄素干预则明显抑制SHR大鼠心肌中两者mRNA表达的升高。钠尿肽的受体有三种，即NPR-A、NPR-B、NPR-C。研究发现，抑制NPR-A而不是NPR-B的表达能诱导H9c2心肌细胞的肥大；NPR-A缺失小鼠表现为高血压和左室心肌肥大[16，17]，可见NPR-A具有抑制心肌肥大、保护心肌的作用。我们发现，与对照大鼠相比，SHR大鼠心脏NPR-A的表达没有明显变化，与林璋等[18]报道压力超负荷性大鼠左心室NPR-A的表达呈动态变化趋势—早期升高，晚期降低—并不一致，可能与高血压大鼠的模型、周龄和程度有关。肾脏中NPR-A、NPR-B mRNA的水平在各组中无显著差异，但是SHR大鼠肾脏中NPR-C mRNA水平明显减弱，而大黄素干预则明显升高其表达，这与Li等[19]报道的NPR-C能降低高血压的结果一致，说明大黄素具有潜在对抗高血压的作用。慢性高血压会引起心肌重构，其发生发展过程中经常伴有心肌凋亡。本研究结果表明，SHR大鼠心肌bcl-2的表达显著降低且bax表达明显升高，使bcl-2/bax降低，而大黄素干预则明显抑制此种变化。ARC是一种在心脏中大量表达的抗凋亡蛋白，具有抑制心肌细胞调亡、保护心肌免受凋亡相关因子损伤的功能[20]。我们发现，SHR大鼠心肌ARC的表达显著降低，大黄素干预能促使其表达升高。这提示大黄素通过增加bcl-2/bax比值和ARC的表达，抑制SHR大鼠心肌细胞的凋亡，进而能改善其心功能。我们所观察到的大黄素抑制SHR大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的结果与Wu等[11]报道的大黄素通过抑制心肌细胞的死亡来防止急性心肌梗死的结果相一致。

总之，大黄素对SHR大鼠心脏功能有改善作用，其机制可能是通过调控钠尿肽系统和心肌细胞凋亡实现的，提示大黄素在高血压致心脏病变的防治方面有潜在的应用前景。