氟西汀灌服对脑缺血大鼠行为学及海马齿状回神经再生的影响

孙晓羽，曲慧玲

(辽宁省人民医院，沈阳 110015)

中风可以导致偏瘫、失语等神经功能损伤，多发生在老年人中[1]。中风分为脑缺血及脑梗塞，目前以脑缺血居多。尽管中风被大量学者研究，但是有效的治疗手段非常少。氟西汀为五羟色胺受体抑制剂(SSRIs)，是治疗抑郁及焦虑的主要临床用药，目前已被广泛的应用于中风后抑郁患者的治疗[2,3]。研究[4～7]显示，氟西汀可促进海马的神经增生、存活、分化及突触的重塑，可以有效地促进中风患者的运动功能的恢复。然而，在动物实验中氟西汀治疗对脑缺血后海马神经再生情况研究甚少。本研究通过制备大鼠脑缺血模型，并给予脑缺血大鼠氟西汀治疗，观察氟西汀对脑缺血大鼠行为学及海马齿状回神经再生的影响，旨在为临床上脑缺血的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性Wistar大鼠54只，体质量220～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器 一抗豚鼠doublecortin(DCX)(Millipore公司，美国)；二抗山羊抗豚鼠488(Invitrogen公司，美国)；激光共聚焦显微镜(FV-1000，德国)。

1.3 实验动物分组、脑缺血模型制备及氟西汀灌服 选取30只大鼠制备脑缺血模型，即采用向纹状体及皮层注射内皮素(ET-1)，根据Paxinos and Watson的大鼠脑解剖图谱以前囟后+0.7 mm、矢状线旁+2.2 mm、硬膜下-2.0 mm及前囟后+2.3 mm、矢状线旁+2.5 mm、硬膜下-2.3 mm和前囟后+0.7 mm、矢状线旁+3.8 mm、硬膜下5.8 mm为进针的位置，向此三点注射0.5 μg/μL的ET-1溶液2.0 μL，并且在注射每个点位后置留5 min，防止液体倒流[8]。模型制作成功的标志为大鼠出现偏瘫症状，若大鼠无偏瘫症状或者死亡则被剔除。30只鼠中有2只因为麻醉死亡，有4只未出现偏瘫症状被剔除，其余24只随机分为氟西汀组和模型组各12只。另取24只大鼠，并随机分为阳性组和阴性组各12只，两组不制备脑缺血模型，仅在相同的解剖注射等量生理盐水。制模7 d后，氟西汀组和阳性组大鼠开始氟西汀用药治疗，即将氟西汀药物溶解在饮水中让大鼠自由摄取，用量为16 mg/(kg·d)[9]，持续3周。

1.4 大鼠行为学测试 氟西汀治疗21 d，进行3 d的平衡木实验。平衡木为一长2 m，直径2.5 cm的圆柱状长竿。大鼠在造模前进行3 d的平衡木训练实验，然后在缺血后29 d进行平衡木测试。平衡木实验要用录像记录下来，重复3次，取平均值。患侧前爪(后爪)的跌落率=患侧前爪(后爪)跌落次数/总爪跌落次数。跌落在平台下面计为完整的一个跌落，半只脚跌落在平台下面算是半次跌落[10]。

1.5 大鼠海马齿状回DCX阳性细胞计数及树突总长度测量 进行3天的平衡木实验后处死各组大鼠，经腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉。暴露心脏，于心尖左缘进针，迅速剪开右心耳，迅速灌注100～200 mL的37 ℃生理盐水至流出液清亮，继之以4 ℃、4%多聚甲醛150～200 mL灌注固定；取脑组织置多聚甲醛固定液中4 ℃过夜。标本置30%的蔗糖溶液中4 ℃保存5 d后更换蔗糖溶液继续保存5 d。根据大鼠脑解剖图谱[11]，包埋后取海马水平(后囟水平2.8～4.3 mm)制作连续冠状冰冻切片，片厚40 μm，每只大鼠共取5张切片，然后将切片冻存于-20 ℃的防冻中作免疫荧光染色备用。新生神经细胞的标志物DCX的免疫荧光染色采用漂片法[6]。先将切片用PBS洗10 min，共3次。切片置于山羊血清封闭液中孵育90 min。然后加一抗豚鼠抗DCX(1∶800)4 ℃过夜。第2天，把切片拿出来复温30 min，然后PBS洗10 min，共3次。加二抗山羊抗豚鼠488(1∶500)室温避光孵育2 h。用PBS洗10 min，共3次。贴片后用抗荧光淬灭封片液封片。采用激光共聚焦显微镜在20倍视野下观察海马齿状回区域DCX阳性细胞，NIH ImageJ图像分析软件计数每只大鼠每个视野的平均DCX阳性细胞数以及树突的总长度。

2 结果

2.1 各组大鼠前爪、后抓跌落率比较 大鼠前爪、后抓跌落率比较见表1。

表1 各组大鼠前爪、后抓跌落率比较

注：与阴性组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 各组大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数、树突总长度比较 大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数、树突总长度比较见表2。

表2 各组大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数、树突总长度比较

注：与阴性组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨论

脑中风分为脑缺血及脑梗塞，其中以脑缺血居多，是人类致死率和致残率高的疾病，大多数患者会根据梗塞的大小及部位不同而遗留不同程度的感觉、运动、认知、行为、交流或情感功能的缺失。因此，脑中风导致的神经功能缺失不仅仅会威胁生命，还会影响存活者的生活质量。在脑中风3 h内，可以用阿替普酶(t-PA)溶栓治疗，但由于时间窗的限制及禁忌证等符合条件的患者少之又少。目前，机械取栓治疗也是脑梗塞的一种手段，但也受时间窗的限制，且花费较大，风险较高，一般患者难以接受。因此，积极寻找能够使神经细胞再生方法，从而促进神经功能的恢复，将成为脑梗死治疗的新策略。

氟西汀是一种中枢神经系统的SSRIs，广泛用于抑郁患者的治疗。氟西汀还可以用于中风后抑郁的治疗，但治疗效果很局限。一些研究表明，SSRIs的预防性治疗在某种疾病中可以阻止抑郁的进展。近期研究[12]表明，SSRIs可以有效促进中风患者的运动功能的恢复。已经有研究[13]证实，氟西汀可以使海马齿状回成熟神经元的树突增长。但是氟西汀对缺血大鼠的海马齿状回神经细胞的增殖情况尚不知晓。我们的实验是用特定标记物DCX来标记海马区域的神经细增殖情况，DCX是一种微管相关蛋白，用免疫荧光染色可以清楚地显示神经细胞情况，本文结果显示经氟西汀治疗后缺血大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数明显增加，同时氟西汀还可以树突长度，即表明氟西汀治疗对脑缺血的神经增殖有一定的价值，为临床是脑梗死的治疗提供一种新的手段。但是氟西汀治疗对神经细胞的存活以及分化的影响尚未阐明。目前为止，氟西汀促进海马齿状回神经发生的机制尚不清楚[7]。在生理条件下或者病理条件下，脑源性神经生长因子(BDNF)在调节神经增生方面起着关键作用[14,15]。有研究[16]表明，氟西汀不仅可以增加BDNF在正常大鼠脑中的表达，也可以增加在短暂性脑缺血大鼠海马CA1区域的表达。最近研究[17]显示，脑缺血后SSRI类药物西普肽兰的治疗可以增加梗死区域BDNF的表达，并且还可以增加神经前体细胞(NPC)增殖以及新生神经细胞从侧脑室(SVZ)迁移到梗死区域的距离。因此，氟西汀促进脑缺血后DG区域神经增生是由BDNF介导的这种机制猜测是合理的，尽管BDNF在脑缺血后氟西汀治疗的大鼠脑中并没有监测表达情况。另外一种可能的机制是与血管内皮细胞增生有关。有研究[18～20]表明，脑缺血后大脑修复过程中血管内皮与神经细胞的增生是相互协调与联系的。在脑缺血后梗死区域新生血管内皮细胞会分泌SDF1α、MMPs或VEGF去调节神经干细胞的生理活动[21～23]。有研究证实，SSRI类西普肽兰在梗死区域可以显著增加毛细血管的密度。所以，我们猜测氟西汀引起的缺血后神经再生可能与血管内皮细胞增生有关，但遗憾的是我们的研究没有发现氟西汀对运动功能的影响[24～26]。也许在脑缺血的患者中，通过氟西汀的治疗，他们更愿意主动地去参与功能康复训练，然而在动物的中风模型中，这种抑郁的情绪是很少存在的，所以氟西汀对运动功能的恢复并没有改善。

总之，氟西汀对脑缺血大鼠行为学没有影响，但能促进大鼠神经再生。