Bax、Bad基因真核表达质粒构建及转染人胚肾细胞后的翻译水平观察

王孜恒，周敬伟，侯筱宇

(1徐州医科大学，江苏徐州 221000；2江苏省脑病生物信息重点实验室)

凋亡最早是由英国病理学家Kerr JF教授于1972年根据细胞形态学改变提出的概念，是指细胞在接受外界信号刺激后启动的主动的程序性细胞死亡过程[1]。在人体内每天约有1×109个细胞发生凋亡[2]。细胞凋亡涉及内源性凋亡途径和外源性凋亡途径，内外途径协同工作，清除体内有缺陷的细胞，使机体保持健康，而不受控制的细胞增殖会导致癌症[3]等疾病的发生发展。重大脑疾病如缺血性脑血管病[4,5]、阿尔茨海默病[6]、帕金森病[7]等均与选择性的神经元凋亡有关。深入研究选择性神经元凋亡的信号传递及调控有助于发现潜在的治疗药物靶点。研究表明，Bcl-2家族蛋白可促进或抑制细胞凋亡，取决于它们的表达谱、定位或构象。Bax是首个发现的能够促进细胞凋亡的蛋白质，也是目前认为细胞凋亡中最为关键的分子[8]，其编码的蛋白质由192个氨基酸组成，分子量为20 kD[9]。凋亡应激时，Bax从胞质向线粒体转移并形成寡聚体锚定在线粒体外膜上介导细胞凋亡[10]。Bad是只含有BH3结构域的促凋亡蛋白，由204个氨基酸组成，分子量为23 kD[11]。Bad能够促使Bax释放并向线粒体转移，其在细胞凋亡中发挥的作用同样不可忽视。但是Bax和Bad在选择性神经元凋亡过程中的调控机制还有待进一步阐明。本研究通过构建Bax、Bad基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad，并观察Bax、Bad在HEK293细胞中的表达情况，旨在为进一步研究脑疾病发生发展中Bax和Bad的亚细胞分布、线粒体转位及其调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 真核表达载体、菌株和细胞株 真核表达载体pcDNA3.1为本实验室保存，大肠杆菌DH5α感受态细胞购买于博迈德生物，人胚肾细胞(HEK293细胞)为本实验室保存。

1.2 主要试剂 TRIzol Reagent购自Ambion公司;PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMKpn I、QuickCutTMXho I、T4 DNA Ligase及DNA Marker购自Takara公司；LB AGAR及LB BROTH BASE购自Invitrogen公司；SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒及SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自Sango Biotech公司；Agarose购自SunShineBio公司；PureLinkTMHiPure Plasmid Midiprep Kit购自Thermo Fisher公司；PEI购自Sigma公司；兔源Bax单克隆抗体、兔源Bad单克隆抗体及鼠源β-actin多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 Bax、Bad真核表达质粒(pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad)的构建 ①引物设计与合成：采用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的DNA序列数据库查找Bax以及Bad的cDNA序列，根据其序列和pcDNA3.1载体上的多克隆位点，依据引物设计的一般原则，使用Primer Premier 5引物设计软件设计引物，并加上合适的限制性内切酶位点。引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：Bax上游引物序列为5’-CGGAATTCCACGTCTGCGGGGAGTCACGTG-3’，酶切位点EcoRⅠ，下游引物序列为5’-CCGCTCGAGAAGGCAGCAGGAAGCCTCAGCC-3’，酶切位点XhoⅠ；Bad上游引物序列为5’-GGGGTACCATGGGAACCCCAAAGCAGCCCT-3’，酶切位点KpnⅠ，下游引物序列为5’-CCGCTCGAGGGGCGA-TGGGAGCGGGTAGAAT-3’，酶切位点XhoⅠ。②目的基因的扩增：采用雄性健康SD大鼠脑组织为材料，使用RNA抽提试剂盒提取大鼠脑组织总RNA。使用目的基因特异性上下游引物进行RT-PCR扩增，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳鉴定。③真核表达载体的构建：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，回收纯化产物使用特异性限制内切酶进行双酶切后连接至pcDNA3.1表达载体，筛选阳性真核表达质粒并进行双酶切电泳鉴定。取10 μL质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证。

1.4 质粒转染至人胚肾细胞后Bax、Bad表达观察 ①HEK293细胞的培养和pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad转染：HEK293细胞在37 ℃含5%CO2的温箱中培养，培养基使用含10%小牛血清的高糖DMEM培养基。将真核表达质粒和脂质体分别稀释于适量培养基中，静置5 min后将真核表达质粒与脂质体均匀混合，室温放置20 min，等待时将细胞培养基更换为不含血清的培养基，20 min后将真核表达质粒脂质体混合物逐滴加入细胞培养基中，4 h后更换含10%小牛血清的高糖DMEM培养基，24 h后收集细胞。②免疫印迹分析：将细胞超声破碎后按改良Lowry法测定细胞蛋白总量，取相同蛋白量的细胞样品经15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。将膜置于封闭液(3%BSA)中室温孵育3 h，一抗工作液(Bax为1∶1 000；Bad为1∶10 000)中4 ℃孵育过夜，洗涤缓冲液洗膜5 min×3次，加入二抗工作液(1∶10 000)，室温孵育1 h，洗涤缓冲液洗膜5 min×6次，曝光，扫描膜上显色条带。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad的鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出的cDNA序列大小和Bax(680 bp)、Bad(660 bp)基因片段大小一致，见图1；培养的单菌落提取质粒后进行双酶切电泳鉴定，酶切产物和目的基因大小一致，见图2；南京金斯瑞生物科技有限公司测序结果与NCBI的DNA序列数据库中Bax、Bad的cDNA序列完全一致。上述结果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表达质粒构建成功。

注：A:Bax 680 bp；B：Bad 660 bp。

注：A:pcDNA3.1-Bax；B：pcDNA3.1-Bad。

2.2 HEK293细胞中Bax、Bad表达水平 转染pcDNA3.1-Bax真核表达质粒组在相对分子质量约20 kD处检测到Bax过表达条带，转染pcDNA3.1-Bad真核表达质粒组在相对分子质量约23 kD处检测到Bad过表达条带(Bad上方条带可能为其修饰条带)，见图3。结果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表达质粒在HEK293细胞中成功过表达。

注：A:Bax;B:Bad。

3 讨论

目前认为在细胞凋亡中Bax是最为重要的分子，在线粒体凋亡途径中发挥非常关键的作用。在正常生理状态下，Bax在胞质和线粒体外膜上动态转移，处于平衡状态[12]，而在应激条件下，Bax从胞质向线粒体转移后并不能再次回到胞质，而是锚定在线粒体外膜形成寡聚体，介导凋亡的发生发展[13]。Bax是首个发现能够和Bcl-2蛋白直接相互作用的蛋白，两者之间能够形成异源二聚体进而起到共同调节细胞凋亡的作用[14]。在生理状态下，细胞内的Bcl-2蛋白能够和Bax蛋白结合，将Bax稳定在胞质中，起到抑制细胞凋亡的作用。当细胞遭遇外界或者内部应激时，Bax在Bad等促凋亡蛋白作用下，和Bcl-2或其他抗凋亡蛋白解离，Bax向线粒体转移并锚定在线粒体外膜上，进而形成寡聚体促使线粒体通透性增加，释放细胞色素C，进而启动凋亡程序[15]。因此有研究认为Bcl-2和Bax之间的动态平衡对细胞的存活尤其重要。Bad能够发挥促凋亡作用主要依赖于促凋亡蛋白最重要的功能区即BH3结构域，目前所报道的包含BH3结构域的蛋白均为促凋亡蛋白家族成员，并且都可以通过和凋亡抑制蛋白相互作用进而发挥促凋亡功能[16]。目前是否存在Bcl-2家族以外的蛋白调节Bax在胞质和线粒体之间的转移进而调控内源性凋亡途径我们不得而知，在这个过程中Bad又扮演着怎样的角色还尚不清楚，均有待于进一步探究。

缺血性脑卒中是多因素、多细胞介导的病理损伤过程，其损伤机制非常复杂，迄今为止医学上仍无法完全阐明[17]。目前国际上对于缺血性脑卒中公认的治疗方案是尽早恢复或重建血流再灌注[18]，但再灌注会使神经细胞产生快速的级联损伤反应，从而进一步加重缺血组织的病理损伤，最终导致神经细胞自身凋亡。脑缺血再灌注后会诱导蛋白表达量发生变化，其中促凋亡蛋白以及抗凋亡蛋白的改变对细胞凋亡的发生发展尤为重要，而在这其中Bcl-2家族蛋白发挥重要作用[19]。在机体正常生理状态下，Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白都处于细胞中某一固定的位置中。一般来说，抗凋亡蛋白主要是膜内蛋白，可以靶定在线粒体膜、细胞核膜以及内质网膜上；促凋亡蛋白一般存在于细胞质中，少数松散的黏附在线粒体表面。在凋亡刺激信号作用下，BH3结构域亚家族蛋白如Bad、tBid能与Bcl-2样抗凋亡亚家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xl形成的凹槽结合，置换出促凋亡蛋白Bax/Bak，后者转位至线粒体外膜，促使线粒体膜通透性增强，介导细胞色素C的释放，进而引发细胞凋亡[20]。目前有关脑缺血再灌注后线粒体凋亡途径的研究主要以Bax为核心[21]，但目前关于其他家族蛋白对Bax所介导的线粒体凋亡途径影响的研究还很少，关于其在脑缺血再灌注损伤中的机制研究更是寥寥无几，仍需进一步深入探究。

在本研究中，我们从大鼠脑组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到Bax以及Bad的cDNA序列，使用限制性内切酶进行双酶切后与pcDNA3.1载体进行连接，酶切结果表明Bax和Bad基因序列成功插入到pcDNA3.1载体中，DNA测序及比对结果确定真核表达质粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad中的插入片段和目的基因的CDS区序列完全一致，表明真核表达质粒构建成功。将真核表达质粒转染至HEK293细胞，蛋白免疫印迹证实真核表达质粒在真核细胞中成功过表达。Bax以及Bad真核细胞真核表达质粒的成功构建为研究Bax和Bad的亚细胞分布、线粒体转位及其调控机制奠定基础。对Bax以及Bad进行深入研究不仅对细胞凋亡机制的阐明有重要作用，对脑疾病的靶向治疗也有重要意义。