秦岭红豆杉不同部位黄酮含量及其抗氧化性研究

王云云, 华燕青, 胡永乐, 罗长浩

(1.杨凌职业技术学院 药物与化工分院,陕西 杨凌 712100 ;2. 周至国家自然保护区,陕西 周至 710400 )

红豆杉止痛、解毒、散结，内含紫杉醇和黄酮。临床上主要用于治疗卵巢癌、肺癌、食管癌等恶性疾病，被广泛地应用在医药和食品中。文献显示已从红豆杉属植物中分离出500多种紫杉烷类化合物。利用乙醇对红豆杉的针叶进行提取和分离，并对总黄酮提取工艺进行了优选，并与传统的乙醇回流进行对比，获得了较为理想的黄酮提取工艺参数。

秦岭是我国南北气候、植被、动植物区系的分界线，山势巍峨，地势起伏较大，野生红豆杉资源丰富，主要为南方红豆杉和西藏红豆杉，其中南方红豆杉分布较多[1]。所生红豆杉杆形端正，生长健康，枝叶苍翠，无病害。笔者试验借鉴前人的研究成果，对秦岭野生红豆杉不同部位的黄酮含量进行试验，用超声波提取法，对其提取液进行含量分析和对照，以期得到秦岭红豆杉不同部位在总黄酮量，通过分析比对为开发丰富的秦岭红豆杉药物资源，提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AR2140电子天平，RE-522AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SG2200HE超声波(上海冠特超声仪器有限公司)，UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津)，SHB-3T循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸易有限公司)。

1.2 实验材料

红豆杉，采于2016年10月27日陕西周至自然保护区。经杨凌职业技术学院陈书文教授鉴定为红豆杉科，红豆杉属南方红豆杉。将样品按枝干、树皮、叶三部分分别干燥后，粉碎过60目筛，制成红豆杉粉待用。芦丁对照品(批号：B20771-20 mg B20 10Y19N7525244 CSA#153-18-4 )购自上海源叶生物科技有限公司，无水乙醇，亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝三羟甲基氨基甲烷， HCl， Na2EDTA，连苯三酚均为分析纯。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

准确称量于105℃干燥至恒重的芦丁对照品12.01 mg，用70%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，得0.242 mg·mL-1的标准品溶液。

2.2 最大吸收波长的选择

取对照品溶液和供试品溶液进行波长扫描，发现在500 nm附近吸收较强，故选择500 nm作为测定波长。见图1。

图1 供试品紫外扫描光谱

2.3 芦丁标准曲线的绘制

精密移取芦丁标准品溶液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL，分别加入去离子水到2 mL。加5%硝酸钠溶液0.5 mL,放置6 min，加5 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，摇匀，室温放置10 mim，在500 nm处测吸光度。以吸光度A为纵坐标，以质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线,见图1。线性回归方程为C=0.0772A-0.0057， r=0.984148，芦丁在0.0356～0.4984 mg的范围内呈现较好的线性关系。

图2 标准曲线

2.4 精密度实验

精密量取2.1项下芦丁标准品溶液1.0 mL，依2.3项中显色方法操作，连续6次测定吸光度，结果RSD=1.609%。表明仪器的精密度良好。测量结果见表1。

表1 精密度试验

2.5 稳定性试验

量取同一供试品溶液0.5 mL,依供试品溶液制备成供试品溶液，显色，经15 min、30 min、45 min、60 min、75 min测吸光度。结果RSD=1.16%，表明该方法的重现性良好。

2.6 加样回收率试验

取已知浓度的样品溶液6份，加芦丁标准品溶液适量，依供试品溶液的制备方法制备并显色，测总黄酮，结果平均回收率为98.52%，RSD=1.71%，表明该方法的准确性良好，方法可行。

3 方法与结果

3.1 红豆杉总黄酮提取工艺及工艺参数确定

红豆杉总黄酮超声提取拟采用工艺为：

3.2 超声提取不同部位总黄酮

表2 取样量及稠膏量

三角瓶中加入不同部位红豆杉皮、枝、叶60目粉末，液料比27(V/m)，乙醇体积分数64%，提取时间55 min,超声频率59 kHz，提取次数2次，制备供试品溶液的原液的浓缩液。见表2。

3.3 黄酮含量的测定

取3.2项下的浓缩液1 mL，用NaNO2—Al(OH)3—NaOH显色， 70%乙醇定容于25 mL，为供试品溶液。总黄酮的计算方法为：总黄酮的含量(mg·g-1)=总黄酮的量/红豆杉样品质量。测定结果见表3。黄酮含量比较见图3。

表3 红豆杉不同部位总黄酮含量

图3 红豆杉不同部位黄酮含量比较

3.4 抗氧化活性

3.4.1 溶液配制 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(0.1 mol·L-1)；HCl溶液(0.1 mol·L-1)；Tris-HCl缓冲液(0.05 mol·L-1, pH7.4，含1mmol·L-1Na2EDTA)；60 mmol·L-1连苯三酚溶液。

3.4.2 参比液清除能力测定 试管中加11.8 mL Tris-HCl缓冲液，再加0.2 mL连苯三酚溶液,快速混合后倒入比色皿中，计时开始，隔30 s一次A值(325 nm)，至300 s(5 min)时为止。共三次。

表4 红豆杉不同部位自由基清除能力比较

3.4.3 样品溶液自由基清除能力测定 取超声提取干膏粉,用75%乙醇定容于50 mL容量瓶中，试管中加超滤液2 mL，加0.05 mol·L-1, pH7.4的Tris-HCl缓冲液9.8 mL, 加60 mmol·L-1连苯三酚溶液0.2 mL，混合后倒入比色皿中，开始计时，每隔30 s读数一次A值(325 nm)，至300 s(5 min)时为止。共三次。数据见表4。

空白参比: △A=A325nm,300s-A325nm,30s

样品清除率=(△A空白-△A样)/ △A空白* 100

4 分析与结论

由上表3可见，以芦丁为对照品，用紫外分光光度法，以500 nm为测定波长，利用超声波提取法，选液料比27(V/m)，乙醇体积分数64%，提取时间为55 min,超声频率为59 kHz，提取2次；显示秦岭红豆杉的皮部、枝部、叶部的总黄酮含量为56.6 mg·g-1、 30.13 mg·g-1、33.34 mg·g-1。其中皮部57.51 mg·g-1最高，枝部30.13 mg·g-1最低，叶部总黄酮33.34 mg·g-1。皮部的总黄酮量比枝部高27.38 mg·g-1，比叶部高23.26 mg·g-1,叶部和枝部的含量差异为3.21 mg·g-1，皮部的总黄酮含量是枝部总黄酮的近1倍，枝部和叶部的含量差异不是很大。

由表4可见，红豆杉的皮、枝、叶部黄酮均具有抗氧化活性，其皮、枝、叶中的自由基清除能力依次76．16、47．22、60．48。皮部的抗氧化能力相对较强，枝部的最弱，抗氧化能力与相应部位的黄酮含量相对应。

数据显示在秦岭红豆杉开发利用时，若果以黄酮为活性目标物质，应选择红豆杉的皮为原料，这样可获得较多的总黄酮产品，提取效率高，经济收益较大。