响应面法优化桦菌芝三萜超声提取工艺

黑育荣, 陈胜发, 彭修娟,杨新杰

(1.杨凌职业技术学院, 陕西 杨凌 712100;2.陕西国际商贸学院,陕西 咸阳 712046； 3.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)

桦菌芝 [Pyropolyporusfomentarius(L. ex Fr.)]又名木蹄、多寄生于桦树及栎树的树干上，桦菌芝的药用活性之一是抗癌，民间治疗子宫癌、食道癌、胃癌多有应用[1,2,3]。目前对桦菌芝的研究，主要集中在桦菌芝多糖的抗癌作用机制[4]，桦菌芝的另一抗癌活性成分为三萜类成分[5]，对桦菌芝的三萜类成分的研究较少。笔者实验通过响应曲面分析法优化桦，菌芝三萜类成分的超声提取工艺，给桦菌芝三萜的研究和开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

C2H5OH、浓H2SO4、HClO4、冰CH3COOH、醋酸酐、香草醛等(均为分析纯)。桦菌芝(野生)；齐墩果酸对照品(110709-201607，中国药品生物制品检定所)；

1.2 仪器

YP20002型电子天平，KQ5200DE型数控超声波清洗器，DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱，HH-2型电热恒温水浴锅，SHZ-D(ш)型循环水用真空泵，UPT-I-10T型超纯水机，UV-1901型紫外可见分光光度计。

1.3 试验方法

1.3.1 超声提取桦菌芝三萜 准确称取桦菌芝粉末，置锥形瓶内，以设定浓度的乙醇溶液和料液比，设定超声温度、时间，进行提取，过滤得提取液，测定滤液中桦菌芝三萜的含量，并计算三萜的得率。

1.3.2 对照品溶液的配制 称取适量齐墩果酸对照品，加入一定体积的甲醇，配制成0.1953 mg·mL-1的对照品溶液。

1.3.3 标准曲线的绘制 以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色，以可见分光光度法测定总三萜含量[6]，分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的对照品溶液，分挥干，加入0.2mL 5%香草醛冰乙酸和0.8mL高氯酸，60℃水浴中反应15 min，冰水浴冷却, 加冰乙酸定容到5 mL，同法作为空白，测定550 nm处的吸光度值。以齐墩果酸(mg)x为横坐标，吸光度值(A)y为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 桦菌芝三萜含量测定 准确量取样品液1 mL，置25 mL具塞试管中，挥干溶剂按香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法显色，平行测定3次。

1.3.5 单因素实验 分别考察50%，60%，70%，80%，90%的乙醇浓度，在40℃、50℃、60℃、70 ℃、80℃的条件下超声，分别设定10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的超声时间，以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，对桦菌芝提取液中三帖类物质含量的影响。

1.3.6 响应面优化 分别以乙醇浓度、温度，时间和料液比为因素，以三萜得率为响应值，以Box-Benhnken的原理，进行响应面分析。

1.3.7 分析数据 用Design-Expert.8.0.6.1软件分析数据

2 结果与分析

2.1 标准曲线

如图1，回归方程为：Y =8.8208X + 0.1157，R2=0.9998。

图1 齐墩果酸标准曲线

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度对三萜得率的影响 由图2中可以看出，乙醇浓度为50%～70%之间，三萜得率随着浓度增加逐渐增大，当浓度增大到70%时三萜得率最大。因此，最佳醇乙浓度为70%。

图2 乙醇浓度对三萜得率的影响

2.2.2 提取温度对三萜得率的影响 从图3可知，随着温度的升高三萜得率逐渐增大。温度达到70℃时，三萜得率增加至最大。由70℃到80℃，三萜得率呈下逐渐下降。过高温度可能会对三萜的结构产生破坏从而影响提取率。经分析得出：提取温度应选择70℃。

2.2.3 提取时间对三萜得率的影响 从图4可以看出，在10～15 min，三萜得率缓慢增加，时间为15 min时增加至最高值，而在15～30 min之间，三萜得率呈现逐渐减少的趋势，可以得出，提取时间控制在15 min左右较为适宜。

图3 提取温度对三萜得率的影响

图4 提取时间对三萜得率的影响

2.2.4 料液比对三萜得率的影响 从图5可以看出，料液比为1∶15时三萜得率最大，故本次实验的料液比控制在1∶15。

图5 料液比对三萜得率的影响

2.3 响应面法实验结果

2.3.1 响应面法实验设计 按照单因素实验结果，根据Box-Benhnken中心组合实验设计的原理，进行4因素3水平实验，见表1。

表1 实验因素及水平

2.3.2 回归模型方程建立与方差分析 以桦菌芝提取液中三帖得率为指标，依据Box-Behnken响应曲面法超声提取桦菌芝三萜的工艺优化，得到设计的29组实验结果，见表2。

表2 响应面实验设计及数据处理

应用软件Design-Expert.8.0.6.1进行分析，得到回归模型方程：

R1=-29.02533+0.47512A+0.31737B+0.32043C+0.37260D-3.25×10-4AB+1.00×10-5AC-1.5×10-3AD-5.50×10-4BC+4.2×10-3CD+6×10-3CD-3.0675×10-3A2-2.505×10-3B2-0.01247×C2-0.021720D2

回归分析结果见表3。

表3 回归模型的方差分析

通过表2数据分析可知，此模型的F值是2.99，方程的“Prob> F”数值小于0.05，表明相应因素对响应值影响显著。从回归方程的方差与分析结果看出，该方程的失拟项特别小，说明方程对实验的拟合情况良好。通过以上实验数据及结果分析均可表明该模型用于优化三萜类物质的提取工艺是非常可靠的。

2.3.3 响应面法分析 应用Design-Expert.8.0.6.1软件绘制乙醇浓度、超声提取温度、超声提取时间、料液比等因素交互作用对桦菌芝提取液三萜类物质含量影响的响应曲面图和等值线图，结果详见图6,续图6。

图6 提取液中三萜类物质含量各因素交互作用影响的响应面与等值线

续图6 提取液中三萜类物质含量各因素交互作用影响的响应面与等值线

根据Design-Expert 8.0.6.1 Trial软件对模型方程计算得到：乙醇浓度70.33%、提取温度在69.67℃，提取时间15.20 min料液比为1∶14.98理论值为3.97%。

2.3.4 验证 应用到实际生产中工艺设定为：乙醇浓度70%、超声提取温度70℃、超声提取时间15 min料液比为1∶15。在此条件下，平行实验三次，实际测得桦菌芝三萜得率为3.87%，相比模型的提取率降低了约0.09%左右。由此证明，笔者实验所得最优提取工艺实用可行。

3 结论

以乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比四个因素进行单因素水平实验，然后通过Box-Behnken原理设计，建立出模型，对实验结果进行分析，得到超声提取桦菌芝三帖最优工艺条件：乙醇浓度70%，超声温度70℃，超声时间15 min，料液比1∶15。在最佳工艺条件下重复平行实验，实验结果桦菌芝三萜平均取率为3.87%。笔者试验的理论数据可以为实际的桦菌芝三萜提取工艺优化和工业生产所参考。