中和血清淀粉样蛋白A对咪喹莫特银屑病样小鼠皮损及IL-17A和CCL20的影响

李影，陆家睛，丁杨峰，易雪梅，于宁

（上海市皮肤病医院，上海200443）

血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A，SAA）是一种组织淀粉样蛋白A的前体物质，是常见急性期反应蛋白的一种[1]。在炎症、感染、组织损伤、肿瘤等疾病中均检测到血清SAA升高。笔者的前期研究以及其他学者的研究均显示寻常型银屑病皮损中SAA mRNA和蛋白水平的表达都增加。但是，尚不明确SAA在银屑病角质形成细胞的增殖和分化中发挥怎样的作用。因此，本研究拟通过比较中和咪喹莫特银屑病样小鼠SAA前后皮损和相关细胞因子的变化，探讨其在银屑病发病中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 5%咪喹莫特乳膏（艾达乐，美国3M公司），雌性BALB/c小鼠（购置上海动物实验中心），PCR引物设计（大连宝生物工程有限公司），抗-SAA抗体（LS-C150247，购于美国LifeSpan Bio－Sciences公司），同型IgG（ab37373，购于美国Abcam公司）。

1.2 动物 雌性BALB/c小鼠24只购置上海动物实验中心，6～8周龄，体质量 18～20 g，饲养于天特定病原（SPF）级动物饲养室，室温20～24℃，照明时间12h/d，自由取食。所有小鼠背部剃毛，面积2cm×3cm，外涂5%咪喹莫特乳膏或凡士林62.5 mg，1次/d，连续6 d。分为4组，每组6只。1组：局部凡士林组腹腔注射控制性IgG，2组：局部凡士林组腹腔注射抗-SAA抗体，3组：局部咪喹莫特组腹腔注射IgG，4组：局部咪喹莫特组腹腔注射抗-SAA抗体。所有小鼠在2周后安乐死，并取背部皮肤进行后续检测。

1.3 方法

1.3.1 组织病理 取背部皮损组织1 cm×1 cm，4%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片并行HE染色。

1.3.2 免疫荧光 皮肤组织在冷冻前做好防冻处理，在含20%蔗糖溶液的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中过夜孵育，然后在30%蔗糖溶液PBS中4℃过夜。在最佳的切割温度时包埋剂包裹组织并冻结在液氮中。切割冷冻切片并收集在载玻片上，室温下干燥，储存在-80℃备用。冰冻切片室温放置15 min以防脱片，用 PBS清洗 3次，3～5 min/次，然后用含10%山羊血清的PBS室温下封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，PBS清洗3次，3～5 min/次，加入二抗37℃孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，3～5 min/次，封片后荧光显微镜观察结果并拍照。

1.3.3 皮损中核糖核酸（RNA）的提取和实时定量荧光聚合酶链式反应法（Real-Time PCR）检测皮损中SAA、白细胞介素（IL）-17A和趋化因子20（CCL20）的表达 引物设计合成SAA表达所需的引物序列上游为上游为5′-CGA AGC TTC TTT TCG TTC CTT-3′，下游为 5′-CAC CAT GGC CAA AGA ATC TC-3′；内参 GAPDH 上游 5′-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3′；下游 5′-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3′；IL-17A 5′-TTTAAC TCC CTT GGC GCA AAA-3′，5′-CTTTCC CTC CGC ATT GAC AC-3′；CCL20 5′-GCCTCT CGT ACA TAC AGA CGC-3′，5′-CCAGTT CTG CTT TGG ATC AGC-3′。选用两管反应体系对目的基因和内参照进行扩增，建立总体积为20 μL的逆转录反应体系。取2 μL cDNA进行PCR扩增，扩增条件：94℃预变性30 s，95℃变性 5 s，58℃退火 34 s，60℃延伸 1 min，共进行40个循环，循环结束后60℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。对寻常型银屑病皮损、非皮损以及正常皮肤组织SAA与GAPDH比值进行单因素方差分析，实验结果以±s表示；采用卡方检验比较SAA蛋白表达阳性率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 咪喹莫特银屑病样小鼠皮损中SAA的表达①咪喹莫特银屑病样小鼠（IMQ）与凡士林对照小鼠（Vas）相比，皮损中SAA mRNA水平明显升高；②用免疫荧光法检测IMQ皮损中SAA的蛋白表达水平高于Vas，见图1。

2.2 中和SAA后IMQ皮损的变化 中和SAA后IMQ与Vas相比，皮损的鳞屑减少，病理显示表皮增生改善，皮损厚度明显变薄，真皮浸润的炎症细胞减少，见图2。

图1 SAA在IMQ皮肤中的表达

2.3 中和SAA后IMQ皮损中IL-17A和CCL20的变化 中和SAA后IMQ与Vas相比，皮损中IL-17A和CCL20mRNA的表达减少，而对照组无变化，见图3。

图2 中和IMQ SAA后皮损的变化

图3 中和IMQ SAA后皮损中IL-17A和CCL20 mRNA的变化

3 讨论

血清淀粉样蛋白是一种高度保守的急性期血浆蛋白，主要由肝脏合成。在急性炎症中，肝脏相当大比例的合成能力用于生产SAA。除了肝脏，SAA还在各种正常组织中如肾、乳腺和肠中合成，以及病变组织包括动脉粥样硬化斑块、老年痴呆症患者的脑组织以及患者的滑液组织等。笔者之前的研究以及Rooney等[3]的研究均表明，银屑病表皮中SAA的表达增加[2-3]。SAA在感染和急性损伤时在周围组织中诱导产生，同时其能促进炎症，部分是通过激发促炎细胞因子的产生和招募颗粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞[4-5]。另外，SAA在调节细胞增殖和凋亡中也发挥重要作用[6-7]。Couderc等[8]研究发现IL-17A诱导角质形成细胞产生急性SAA是银屑病发病机制之一。但是，SAA在银屑病发病中的具体作用机制尚不清楚。

为了进一步明确SAA在银屑病发病中可能的作用，笔者使用IMQ。研究发现IMQ皮损中SAA的表达明显增加，这与银屑病患者皮损中SAA的表达升高一致，使用单克隆抗体中和SAA后，小鼠银屑病样皮损的厚度变薄，真皮浸润的炎性细胞减少，同时银屑病相关的炎性因子IL-17A和CCL20的表达水平也降低。提示中和SAA可减轻银屑病相关的增生和炎症。

SAA的表达是由促炎细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β 和 IL-6 调控的[9]。近期研究发现，SAA在IL-23/Th17通路的活化过程中发挥一定作用。在外周血单核细胞中，SAA可诱导外周血单核细胞分泌IL-23[10]，而IL-23恰恰是Th17细胞分化和表型维持的关键细胞因子。IL-23/Th17通路是银屑病发病的核心机制。推测，SAA可能通过影响IL-23分泌参与银屑病发病，今后有待于进一步在体外实验中去验证。

综上所述，IMQ皮损中SAA的表达明显增加，中和SAA可减轻银屑病相关的增生和炎性因子的表达。因此，SAA在银屑病的发病中起到重要作用，日后可作为银屑病治疗的一个靶点，为银屑病患者提供新的选择。