益气活血通脉颗粒对脑缺血再灌注模型大鼠颞叶神经元损伤的影响

姜瑾， 任平， 刘悦， 许杰， 崔娜， 王璐， 李国信

（1.辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁省中医药研究院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳明华制药有限公司，辽宁沈阳 110135）

大脑中动脉闭塞脑梗死是临床常见的脑血管病，临床表现为偏身感觉障碍、对侧偏瘫、完全性失语等，可因脑水肿、颅内高压而发生脑主干闭塞、皮层性对称侧偏瘫，头面部与上肢重于下肢。在大脑中动脉梗死急性期过后，患者往往遗留严重的神经功能缺损症状[1-3]。中医药治疗脑血管病方面有一定的积累和优势。益气活血通脉颗粒是本院脑病科刘悦教授治疗脑梗死的经验方，以清·王清任《医林改错》中补阳还五汤为主化裁而成，主要成分为黄芪、当归、白芍、川芎、桃仁、红花、地龙、全蝎等，具有益气活血、化瘀通络、舒颈醒脑的作用，在临床应用多年，疗效显著。为进一步探讨其作用机制，本研究以脑缺血再灌注模型大鼠为研究对象，对该方剂进行了与功能主治有关的药效学实验，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物SPF级健康雌性SD大鼠166只，体质量220～260 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001。饲养于辽宁省中医药研究院实验动物中心，室内温度22～25℃，湿度55%～60%，动物使用许可证号：SYXK（辽）2012-0010。本项目的实施已通过辽宁省中医药研究院实验动物伦理委员会有关动物伦理及动物福利的审查。

1.2药物益气活血通脉颗粒，规格：5 g/袋，每袋相当于12 g生药，由辽宁中医药大学附属第二医院中药药剂实验室提供，批号：20151124。用法用量：口服，每次5 g，每日2次。银杏叶片（规格：19.2 mg），由华纳大药厂生产，批号：160217。用法用量：口服，每次1片，每日3次。

1.3试剂大鼠神经生长因子（NGF）免疫组化试剂盒、脑源性神经营养因子（BDNF）免疫组化试剂盒（博士德生物工程有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京Solarbio科技有限公司，批号：5091034）；多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20161203）；无水乙醇（沈阳市新化试剂厂，批号：20160121）；二甲苯（沈阳市新化试剂厂，批号：20151125）；枸橼酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150713）；磷酸缓冲液（PBS，北京Solarbio科技有限公司，批号：20150815）；水合氯醛（北京市旭东化工厂，批号：20000530）。

1.4仪器BX53型光电显微镜（奥林巴斯中国有限公司）；JKDP2型电热恒温培养箱（厦门医疗电子仪器厂）；TP1020自动脱水机、Leica切片机（德国Leica公司）；YG-280KX摊片机（湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司）；YG-280KX烤片机（湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司）。

1.5分组、造模与给药166只大鼠按体质量随机选取16只作为假手术组，其余150只制备脑缺血再灌注模型。采用改良线栓法[4]复制脑缺血再灌注模型：按照3 mL/kg体质量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定到操作台上，颈部褪毛、消毒，分离并结扎颈外动脉和颈总动脉。将栓线经颈外动脉向颈内动脉插入约（18.0±2.0）mm到达大脑中动脉并阻塞大脑中动脉，缺血120 min后，将栓线抽离，确认无出血后用酒精消毒，涂青霉素粉，缝合皮肤。假手术组将线栓插入颈动脉，但未深入到大脑中动脉。术后再灌注4 h后对造模大鼠进行神经功能损伤评分[5]。根据Bederson的神经行为损伤评分标准[6]进行筛选：1～3分者为成功模型，0分、4分或死亡者剔除。将成功的脑缺血再灌注模型大鼠按照其神经功能损伤评分结果随机分为模型组，中药低、中、高剂量组，每组16只。造模结束后，中药低、中、高剂量组给予益气活血通脉颗粒（生药剂量为2.16、4.32、8.64 g·kg-1·d-1，相当于临床成人拟用等效剂量、2倍等效剂量、4倍等效剂量）灌胃，银杏叶片组给予银杏叶片混悬液（剂量为5.18 g·kg-1·d-1，由蒸馏水配制）灌胃，假手术组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。给药体积为10 mL·kg-1·d-1，连续给药5 d。末次给药1 h后，对各组大鼠进行神经功能评价，然后断头取脑，计算脑梗死率、检测颞叶神经元NGF和BDNF的表达。

1.6观察指标与方法

1.6.1 检测神经行为学 神经行为损伤评分标准[6]：无神经功能缺损症状，计0分；不能完全伸展右侧前爪，计1分；自由行走向右侧旋转，计2分；自由活动时向右侧倾倒，计3分；意识丧失，不能行走，计4分。0分、4分或死亡者剔除，1～3分者选为实验对象。

1.6.2 TTC染色[7]观察脑梗死情况 按神经行为损伤评分每组随机抽取10只大鼠，断头处死，取大脑，-20℃冷冻20 min后，将大脑组织切取2 mm厚度冠状位脑片，切成5片，放入2%TTC溶液中，37℃温箱孵育30 min染色，每隔10 min翻动1次。孵育完毕后将脑片置于体积分数10%甲醛中固定2 h后拍照。染色后的脑梗死区呈灰白色。采用Image-J软件测量脑梗死面积，计算脑梗死率。脑梗死率=脑梗死区面积/全脑面积×100%。

1.6.3 免疫组化法检测大鼠脑颞叶神经元NGF和BDNF表达 将各组剩余的6只大鼠按照3 mL/kg体质量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后，将大鼠仰卧位固定到操作台上，开胸暴露心脏，灌注针刺入左心室，右心耳剪一小孔，用生理盐水冲洗至肝脏变白；再用40 g/L多聚甲醛固定液400 mL（由0.01 mol/L PBS配制，pH 7.4）灌流固定，直至身体逐渐僵硬震颤为止[8]。断头、开颅取各组大鼠大脑中动脉供血区域的脑组织行冠状位切片，置于40 g/L多聚甲酸溶液中固定24 h。固定后的脑组织用酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片备用。检测时，将大鼠脑组织切片60℃烘烤4 h，二甲苯透明2次，置于无水乙醇中浸泡5 min、体积分数90%乙醇浸泡4 min、体积分数80%乙醇浸泡3 min、体积分数70%乙醇浸泡2 min，蒸馏水浸泡1 min。滴加体积分数3%H2O2去离子水孵育20 min。PBS缓冲液漂洗5 min。于枸橼酸钠缓冲液（pH 7.0）中高压修复5 min。血清封闭30 min后，加入PBS稀释的一抗（NGF 1∶400、BDNF 1∶550），4℃孵育过夜。PBS缓冲液漂洗5 min。再加入生物素标记的二抗，37℃孵育2 h。PBS缓冲液漂洗5 min。滴加链霉亲和素—过氧化物酶，37℃孵育30 min。PBS缓冲液漂洗5 min。滴加DAB显色剂。自来水漂洗。苏木精复染10 min，自来水漂洗3 s，加入1%盐酸乙醇分化5 s，自来水漂洗30 s。中性树胶封片。采用Image J软件对经免疫组化染色组织进行灰度值分析，计算各组积分光密度（IOD）[9]。

1.7统计方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（-x±s）表示。不符合正态分布者采用秩和检验，满足正态性和方差齐性者采用LSD（L）检验，满足正态性但不满足方差齐性者采用Dunnet’s C（U）检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠神经行为损伤评分比较治疗前：与假手术组比较，各组大鼠神经行为损伤评分均显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组神经行为损伤评分未见显著性差异（P＞0.05）。治疗后：与假手术组比较，模型组神经行为损伤评分显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，中药高剂量组、银杏叶片组神经行为损伤评分均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。

2.2各组大鼠脑梗死率比较与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死率显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，中药中、高剂量组及银杏叶片组大鼠脑梗死率显著降低（P＜0.05）。结果见表2。

2.3各组大鼠脑颞叶神经元NGF和BDNF表达比较NGF：与假手术组比较，模型组大鼠脑颞叶NGF表达有所增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，中药中、高剂量组及银杏叶片组NGF表达水平显著增加（P＜0.05）。BDNF：与假手术组比较，模型组BDNF表达水平显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，中药高剂量组及银杏叶片组BDNF表达水平显著增加（P＜0.05）。结果见表3、图1、图2。

表2 各组大鼠脑梗死率比较Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

表2 各组大鼠脑梗死率比较Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

①P＜0.01，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组银杏叶片组脑梗死率0 19.36±4.13①16.13±4.25 14.76±3.78②13.38±3.21②12.97±4.47②N 10 10 10 10 10 10

表3 各组大鼠脑颞叶神经元NGF和BDNF表达比较Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

表3 各组大鼠脑颞叶神经元NGF和BDNF表达比较Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组银杏叶片组BDNF 0.047±0.011 0.094±0.023①0.105±0.019 0.132±0.024 0.182±0.036②0.249±0.043②N 6 6 6 6 6 6 NGF 0.053±0.009 0.103±0.011 0.155±0.021 0.199±0.043②0.260±0.087②0.281±0.092②

图1 各组大鼠脑颞叶神经元NGF表达结果（免疫组化法，×200）Figure 1 Comparison of the expression of NGF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

3 讨论

脑梗死是由于脑组织局部供血动脉血流突然减少，造成该血管供血区的脑组织缺血、缺氧进而导致脑组织坏死、软化，并伴有相应部位临床症状，如失语、偏瘫等神经功能缺失症状。脑梗死是缺血性脑卒中的总称，是脑血液供应障碍引起的脑部病变[10]。中枢性瘫痪是锥体束受损产生，因上运动神经元受损，失去了对下运动神经元的调控作用而产生的随意运动减弱，其主要表现为肌张力增高[11-13]。周围性瘫痪也称下运动神经元性瘫痪[14]，是因脑干运动神经核受损害产生的瘫痪。因下运动神经元受损，使其所支配的肌肉得不到足够的冲动兴奋，表现为肌张力下降、反射消失。本研究结果显示：给药前，各造模组神经行为损伤评分均比假手术组显著增加，提示大鼠脑中动脉阻塞缺血再灌注模型复制成功。治疗5 d后，模型组神经行为损伤评分较假手术组显著增加，提示大鼠脑中动脉阻塞缺血再灌注模型尚未完全自然恢复。益气活血通脉颗粒各剂量组神经行为损伤评分较模型组均有所降低，呈剂量依赖性，说明益气活血通脉颗粒对大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型具有治疗作用。

图2 各组大鼠脑颞叶神经元BDNF表达结果（免疫组化法，×200）Figure 2 Comparison of the expression of BDNF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

脑是对缺血、缺氧最为敏感的重要器官，脑组织缺血将会引起局部脑组织功能损害，其损害程度与缺血时间长短有关，短期缺血会引起可逆性损害，长时间的缺血会引起梗死，脑梗死所引起的组织学变化表现为脑水肿及脑细胞坏死[15]。益气活血通脉颗粒主要由补气活血药物组成，具有益气活血、化瘀通络的功效，其治疗脑缺血的机制可能与改善微循环、增加缺血区血液供应有关。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死率显著增加。与模型组比较，益气活血通脉颗粒各剂量组脑梗死率显著降低，且呈剂量依赖性。提示益气活血通脉颗粒对短时间大脑中动脉阻塞所引起的脑梗死具有治疗作用。

NGF广泛分布于脑组织，可促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。当NGF效应神经元受到损伤（如外伤损害、缺血缺氧等）神经元将发生一系列的病理改变（如死亡），NGF可以抑制上述神经损伤，同时能影响受损神经元再生时间和再生速度[16，17]。BDNF分布于中枢神经系统内，海马和皮质中的含量最高[18，19]，对脑神经元的生长起重要作用。BDNF可以防止神经元受损死亡，并能够促进受损神经元再生及分化。本研究结果显示，与模型组比较，益气活血通脉颗粒各剂量组颞叶神经元NGF和BDNF表达均增加，且呈剂量依赖性。表明益气活血通脉颗粒可以通过增加颞叶神经元NGF和BDNF表达，进而促进受损神经元的再生及分化，从而起到对大鼠脑中动脉阻塞缺血再灌注损伤的治疗作用。

综上所述，益气活血通脉颗粒对脑缺血再灌注模型大鼠产生的治疗作用可能与增加脑颞叶神经元NGF和BDNF的表达有关。