血清miR-221、MMP-2、MMP-9联合检测对卵巢上皮癌的诊断意义

薛玲玲 马会峰

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌，而致死率却位于女性生殖器官恶性肿瘤首位[1]。卵巢上皮癌约占卵巢恶性肿瘤的85%～90%，因其早期诊断困难，且易发生远处转移，导致患者的五年生存率仅约20%[2]。

近年来研究发现，微小RNA-221(microRNA-221，miR-221)与基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)在卵巢上皮癌患者体内存在异常表达，且与卵巢上皮癌的发生、侵袭转移等过程密切相关[3-5]。在本次实验中，我们通过比较分析卵巢上皮癌患者与健康女性的血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，并分析三者与卵巢上皮癌临床病理特征及发病风险之间的关系，旨在寻找更稳定有效的生物标志物，以期为卵巢上皮癌的诊断提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象的纳入与基本资料采集

收取我院2012年9月至2017年12月确诊的卵巢上皮癌患者210例为病例组，患者年龄37～73岁，平均年龄(48.6±10.9)岁。其中Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期患者153例。患者均为首次住院且经病理学确诊为卵巢上皮癌。卵巢上皮癌的分期参照国际妇产科联合会制定的FIGO分期系统(2013)[6]。对照组来源于同期在我院行常规体检的健康女性250例，年龄35～71岁，平均年龄(46.3±11.2)岁。由研究人员对研究对象的BMI、吸烟史、饮酒史等基本资料进行采集。所有研究对象均排除其他系统恶性肿瘤、糖尿病、严重的心脑血管疾病及自身免疫性疾病。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2 血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平的检测

受试者禁食10 h以上，次日清晨由专业医护人员使用含促凝剂采血管抽取静脉血10 ml，血液标本在1 h内于4 ℃条件下以12 000 g离心力离心15 min，收集上层血清进行相关指标检测。

血清总RNA的提取按照血液RNA提起试剂盒(中国Bioteke公司)说明书步骤进行。取提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒(中国Takara公司)逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)法检测血清miR-221及内参基因GAPDH表达水平。检测过程中所用引物序列如下：miR-221上游引物：5'-AGTGTGTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3'下游引物：5'-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；采用2-ΔΔCt法计算miR-221的相对表达量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

血清MMP-2、MMP-9的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司提供，检测仪器为多功能酶标仪DR-3506(无锡华卫德朗)，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象的基本临床资料与血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

病例组和对照组的临床基本信息与血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，见表1。两组在年龄、吸烟史、饮酒史等方面均无显著差异(P>0.05)。相比于对照组，血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平在卵巢上皮癌患者中显著升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 研究对象的临床基本信息与血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

2.2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平与卵巢上皮癌临床病理特征的关系

如表2所示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平与卵巢上皮癌患者的年龄、BMI、吸烟史、饮酒史等因素均无显著相关性(P>0.05)，而与卵巢上皮癌的FIGO分期显著相关(P<0.05)，三者水平在Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌患者中的增高最为明显。

表2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平与卵巢上皮癌患者临床病理特征的关系

2.3 ROC曲线分析

ROC曲线(图1)分析显示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9在区分卵巢上皮癌与健康女性的AUC分别为：0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.704(95%CI：0.613～0.995，P<0.001)；灵敏度和特异度分别为：79.7%/92.8%，63.8%/90.3%，49.3%/86.7%(图1A/B/C)；诊断界值分别为：8.6(-log)、45.6 pg/ml和30.2 pg/ml。当联合血清miR-221、MMP-2和MMP-9时，区分卵巢上皮癌与健康女性的AUC为0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，灵敏度为84.1%，特异度为92.3%(图1D)。

2.4 风险评估

单因素分析显示，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平是卵巢上皮癌发病的危险因素；多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟史、饮酒史等因素的影响后，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平仍是卵巢上皮癌发病的独立危险因素，见表3。

3 讨论

miR-221是1种最新发现的基因调控因子，能在转录后水平抑制靶基因的表达或蛋白质翻译，已被证实在肝癌、胃癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌等多种肿瘤中异常高表达[7-9]。高表达的miR-221通过对其靶基因，如抑癌基因CDKN1B(p27kip1)、CDKN1C(p57kip2)、MMAC1(PTEN)转录后负性调控而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞增殖、迁移[10]。周宁等[11]通过脂质体转染含有miR-221 sponge的质粒，下调卵巢癌细胞中miR-221的表达水平后，发现卵巢癌细胞的增殖能力与迁移能力会显著下降。朱小丹等[12]的研究进一步证实，瞬时转染miR-221 mimics的卵巢上皮癌细胞，其增殖与迁移能力均受到明显抑制。在本次研究中，我们发现血清miR-221在卵巢上皮癌患者中水平显著高于健康女性，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最明显。ROC分析表明，血清miR-221鉴别卵巢上皮癌与健康女性的灵敏度79.7%，表明miR-221对卵巢上皮癌的诊断具有潜在价值。

A为血清miR-221对卵巢上皮癌鉴别诊断的ROC曲线；B为血清MMP-2对卵巢上皮癌鉴别诊断的ROC曲线；C为血清MMP-9对卵巢上皮癌鉴别诊断的ROC曲线；D为联合血清miR-221、MMP-2和MMP-9对卵巢上皮癌鉴别诊断的ROC曲线。

项目单因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PmiR-221(-log)2.32(1.79～4.31)0.0722.02(1.33～4.41)0.213MMP-2/(pg·ml-1)5.38(2.69～8.91)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MMP-9/(pg·ml-1)4.61(2.08～6.33)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

MMP-2、MMP-9是癌细胞侵袭、转移过程中的两个关键酶。二者的激活可以形成Ⅳ型胶原酶，降解细胞外基质，破坏完整的基底膜，促进癌细胞浸润周围组织，侵入血管和淋巴管，向远处转移[13-14]。目前，关于MMP-2、MMP-9与卵巢癌的相关研究已取得较大进展。申丽媛等[15]对47例卵巢癌、30例卵巢良性肿瘤和21例正常卵巢组织中MMP-2、MMP-9的表达进行检测发现，MMP-2及MMP-9在卵巢癌中的表达水平均高于正常卵巢组织及卵巢良性组织，且二者与卵巢癌的临床分期相关。Che等[16]的体外实验发现，高分泌的MMP-2、MMP-9可通过C3G/Rap1信号通路增强卵巢上皮癌细胞的侵袭能力，这可能是高水平MMP-2、MMP-9预示卵巢癌不良预后的原因之一。在本次研究中，我们证实卵巢上皮癌患者的血清MMP-2、MMP-9水平较健康女性显著增高，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最为显著，二者鉴别卵巢上皮癌与健康女性的特异度分别为90.3%和86.7%。当联合检测血清miR-221、MMP-2与MMP-9三项指标时，灵敏度高达84.1%，特异度为92.3%，优于单项指标检测。此外我们还对血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平与卵巢上皮癌发病风险进行了分析，结果表明，高表达的miR-221、MMP-2、MMP-9均为卵巢上皮癌发病的独立危险因素，提示定期检测上述三者水平，对卵巢上皮癌的发病具有预测价值。

本研究尚存在以下不足之处：①研究中收集的病例数有限，未来还需更多多中心大样本的前瞻性研究对本研究结果进行验证；②本次研究未对miR-221、MMP-2、MMP-9参与卵巢上皮癌发病的机制进行深入挖掘，未来可设计相应的细胞实验和动物实验进行探究。

综上所述，在本次研究中，我们首次探究了联合检测血清miR-221、MMP-2、MMP-9三项指标对卵巢上皮癌的诊断与发病风险预测价值，有望为卵巢癌的临床诊疗提供新思路。