慢性丙型肝炎和丙型肝炎肝硬化患者外周血Treg和Th17水平变化临床意义探讨*

杨才勇，陈 娜，李 奎，江自成，卜蓉蓉

研究指出[1-3]，Treg细胞和Th17细胞在各种病毒性肝炎的发病和病情进展过程中均发挥重要的作用。Treg细胞和Th17细胞分别发挥抗炎和促炎作用，Treg/Th17比值失衡可能是造成肝脏免疫损伤性炎症或促进病毒感染慢性化的关键环节之一[4]。本研究检测了慢性丙型肝炎（CHC）和丙型肝炎肝硬化患者外周血Treg和Th17细胞比例的变化，并分析了其临床意义，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2017年3月～2019年1月我院收治的CHC患者31例，男性15例，女性16例；平均年龄为（38.12±6.63）岁。丙型肝炎肝硬化患者35例，男性17例，女性18例；平均年龄为（45.32±9.25）岁。诊断符合《丙型肝炎防治指南》[4]的诊断标准，血清抗-HCV和HCV RNA阳性，入组前未曾接受抗病毒和护肝治疗。排除标准：（1）入组前3个月内应用过免疫抑制剂者；（2）伴自身免疫性、药物性、酒精性肝病或其他病原体感染者；（3）伴原发性肝癌者；（4）伴巨细胞病毒或HIV感染者；（5）有癫痫、精神疾病史者；（6）失代偿期肝硬化者；（7）基线血清Cr水平大于1.5倍正常值上限、血小板＜90×109/L、中性粒细胞＜1.5×109/L或男性血红蛋白低于正常下限者。另选同期来院行健康体检者66例作为对照组，男39例，女27例；年龄33～62岁，平均年龄为（43.01±8.58）岁。受试者签署知情同意书，本研究经我院医学伦理学委员会审核批准。

1.2 血清细胞因子水平检测 采用ELISA法检测血清白细胞介素-6（IL-6）、IL-17和转化生长因子-β（TGF-β）。

1.3 外周血Treg和Th17细胞检测 抽取空腹静脉血6 ml，经Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMCs），调整细胞数至2×106/ml。取PBMC悬液2 ml，加至6孔板内，再加25ng/ml佛波酯、1 μg/ml离子霉素、1.7 μg/ml莫能菌素，置于5%CO2细胞培养箱37℃下培养5 h。收集细胞，分为测定管和对照管，各100 μl。加抗 CD3-PC5 10 μl、抗CD8-PE单克隆抗体20 μl，室温、避光孵育15 min。加固定液100μl，室温、避光反应15 min。加PBS 3 ml，混匀离心，弃去上清液。加破膜液100 μl。在2管，均加 IL-17A-FITC 20 μl。室温/避光孵育20 min，加 PBS 3 ml，静置10 min。离心、弃去上清液，加PBS 0.5 ml重悬，上流式细胞仪（美国Beckman）检测。根据CD3和CD8圈定T淋巴细胞群，测定Th17细胞（CD3+CD8-IL-17+T）。取静脉血100 μl，加抗CD127-PE 单克隆抗体20 μl、抗CD4-FITC单克隆抗体20 μl、抗CD25-PC5单克隆抗体10 μl。混匀，避光孵育20 min。加红细胞裂解液2 ml，混匀，避光孵育20 min。加PBS溶液3 ml，洗涤，加PBS 0.5 ml重悬，上机测定 Treg细胞（CD4+CD25highCD127lowT）。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料用（±s）表示，采用t检验；另绘制ROC曲线观察各指标对肝硬化的预测价值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组人群血清细胞因子水平比较 丙型肝炎肝硬化患者血清IL-6、IL-17和TGF-β水平显著高于健康人或CHC患者（P＜0.05，表1）；绘制 ROC 曲线，结果提示血清高水平的TGF-β能预测肝硬化的发生（AUC=0.963，P=0.000），而血清 IL-6和IL-17预测的AUC则分别为0.267和0.624，P=0.470，P=0.057（图1）。

表1 三组血清细胞因子水平（±s）比较

表1 三组血清细胞因子水平（±s）比较

与健康人比，①P＜0.05；与丙型肝炎比，②P＜0.05

例数 IL-6（ng/L） IL-17（ng/L） TGF-β（ng/L）丙型肝炎 35 7.20±2.49① 14.12±3.87① 4.41±1.20肝硬化 31 8.08±2.71①② 17.01±4.55①② 5.20±1.35①②健康人 66 6.64±2.33 12.76±3.46 4.19±1.07

图1 血清TGF-β、IL-6和IL-17预测肝硬化的ROC曲线

2.2 三组人群外周血Treg和Th17细胞比率比较 肝硬化患者外周血Treg细胞显著高于，而Th17/Treg比值显著低于CHC或健康人（P＜0.05，表2）。ROC曲线分析显示外周血Treg细胞比率或Th17/Treg细胞比值可有效预测肝硬化【AUC=0.820和AUC=0.607，P=0.000，P=0.041，图2】，而 TH17 细胞对肝硬化无预测价值。

表2 三组人群外周血Treg和Th17细胞（±s）的比较

表2 三组人群外周血Treg和Th17细胞（±s）的比较

与其他两组比，①P＜0.05

例数 Treg细胞（%） Th17细胞（%） Th17/Treg比值肝硬化 35 6.27±1.02① 1.22±0.27 0.19±0.05①丙型肝炎 31 5.75±0.84 1.35±0.32 0.23±0.06健康人 66 5.37±0.99 1.16±0.24 0.22±0.05

图2 外周血Treg、TH17细胞和Th17/Treg细胞比值预测肝硬化的ROC曲线

3 讨论

近年来，一类不同于Th1和Th2细胞的Th细胞引起临床关注，由于其主要分泌IL-17，故命名为Th17[6]。Th17与多种疾病的炎症和免疫过程的关联受到学界的重视。已有证据表明[7，8]，Th17细胞在炎症介导过程中发挥重要的作用，Treg细胞则是免疫抑制细胞，Th17/Treg比值失衡被认为是HCV感染慢性化的关键机制。

在本研究中，慢性丙型肝炎外周血Th17细胞比率和血清IL-17水平分别为（1.35±0.32）%和（17.01±4.55） ng/L，均较健康人的（1.16±0.24） %和（12.76±3.46） ng/L 明显升高，血清 IL-6、IL-17和TGF-β异常升高可能提示HCV感染已经进入慢性阶段，异常升高的TGF-β水平可能提示肝硬化发生的风险增加，而应该及时进行有关检查，以早期做出诊断。HCV感染后肝实质细胞释放的胸腺基质淋巴细胞生成素对Th17细胞造成较大刺激而促进了Th17细胞分泌细胞因子[6-10]。Th17细胞的增加又会促进血清IL-17的分泌，发挥抑制肝细胞凋亡的作用[11，12]。动物实验研究发现[13]，Th17 细胞表达的上调会加重肝细胞炎症和肝硬化的发生。本研究结果发现，肝硬化患者外周血Th17细胞和血清IL-17水平比慢性丙型肝炎患者升高不明显，可能提示HCV感染患者Th17细胞增多有利于HCV感染的自行恢复，对肝硬化的发生有一定的保护作用，与上述研究结论相悖，考虑与研究对象不同有关，具体原因尚不明确，有待进一步验证。机体感染HCV后，受到感染的肝实质细胞会释放胸腺基质淋巴细胞生成素，对Th17细胞造成刺激而促进Th17细胞分化，增加了IL-17的分泌[14]，故与健康人相比，慢性丙型肝炎患者外周血Th17细胞比率和血清IL-17水平均相对升高，与本研究所得结论类似。Th17细胞的增多又会进一步加重肝细胞炎症，诱导肝硬化的发生。也有学者认为[15]，HCV感染后Th17细胞的增加是一种保护效应，主要通过增加IL-17的分泌，抑制受到HCV感染的肝细胞的凋亡，使肝细胞免受损伤，并抑制HCV感染扩散。

肝硬化患者外周血Treg细胞和血清TGF-β水平的变化保持相同的趋势，肝硬化患者外周血Treg细胞为（6.27±1.02）%，显著高于慢性丙型肝炎患者的（5.75±0.84）%或健康人的（5.37±0.99）%，血清TGF-β水平为（5.20±1.35）ng/L，显著高于慢性丙型肝炎患者的（4.41±1.20）ng/L或健康人的（4.19±1.07）ng/L。ROC曲线分析研究显示Treg细胞比率或Th17/Treg比值能提示肝硬化的发生，而在慢性丙型肝炎患者，它们的升高不明显。机体感染HCV后肝细胞中半乳糖凝集素和GF-β表达增强，诱导了Treg细胞分化，抑制HCV特异性T细胞的增殖和相关细胞因子的分泌[16]，故随着HCV感染患者病情的加重，Treg细胞比率和血清TGF-β水平升高，显著高于健康人。病情进一步进展至肝硬化后，Treg细胞比率和血清TGF-β水平会持续升高，考虑Treg细胞分化与TGF-β高表达是HCV感染患者进展为肝硬化的主要机制之一，在丙型肝炎慢性化发生发展过程中发挥促进作用[17，18]。TGF-β主要由肝窦内皮细胞合成和分泌，其具有激活肝星状细胞的作用，被公认是肝脏纤维化的主要原因[19，20]。我们认为，机体感染HCV后诱导肝内细胞表达TGF-β，诱导Treg细胞分化，造成丙型肝炎慢性化，并在该过程中出现肝纤维化。另外，慢性丙型肝炎患者血清IL-6水平显著高于健康人，提示低浓度的IL-6和TGF-β水平可能是通过协同作用，促进Treg细胞分化，造成Th17/Treg细胞比值失衡，使HCV感染患者发生慢性化感染，并促进肝硬化进展[21，22]。有证据表明，采用抗病毒治疗的丙型肝炎肝硬化患者在治疗后，血清HCV RNA水平大幅降低，患者Treg细胞比率也明显降低，Th17/Treg细胞比值平衡恢复，对HCV特异性Th17细胞的抑制作用增强，部分受损Th17细胞功能得以恢复，减少了IL-17的分泌，增强了抗病毒作用。