黄芪甲苷对CCL4所致肝损伤大鼠的保护作用*

徐 飞，李伟荣

近年来，临床广泛开展的中药抗肝损伤的实验研究为临床治疗提供了许多新思路[1-3]。现已证实许多中药，如莪术散、复元活血汤、丹参饮等对肝脏具有很好的抗损伤和保护作用[4]。黄芪为豆科植物内蒙黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、脱毒生肌等功效[5]。黄芪甲苷作为黄芪的主要成分，能通过各种信号通路，发挥抗糖尿病、抗纤维化、抗炎、抗氧化应激、免疫调节和心脏保护等多种功效[6]。大量研究发现黄芪甲苷对于糖尿病、心血管疾病和恶性肿瘤等多种疾病均有很好的疗效，但是在国内外黄芪甲苷的护肝作用研究还鲜见报道[7]。本研究采用CCL4建立大鼠肝损伤模型，予以不同剂量的黄芪甲苷干预，观察了黄芪甲苷对肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 健康成年雌性SD大鼠50只，体质量为（220±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号【SCXK（京）2017-0022】。饲养条件符合清洁级标准。黄芪甲苷购于上海阿拉丁试剂有限公司（纯度≥98%），CCl4（分析纯）购于汕头市西陇化工有限公司，检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，检测血生化和羟脯氨酸（Hyp）试剂盒均购于上海科华生物工程股份有限公司，原位末端转移酶标记技术（TUNEL）染色试剂盒购于瑞士罗氏公司。Synergy HT型多功能酶标仪购于美国Biotek公司，倒置荧光显微镜购于德国ZEISS公司，石蜡包埋机购于日本Tissue-TEK公司，自动生化分析仪购于日本日立公司，紫外可见分光光度计购于上海棱光技术有限公司。

1.2 肝损伤模型制备 适应性喂养大鼠1 w，随机将其分为对照组、模型组和小、中、大剂量黄芪甲苷处理组，每组10只。参照文献行肝损伤大鼠模型制备[8]。在模型组和黄芪甲苷处理组，均给予40%CCL4玉米油溶液1.5 ml·kg-1静脉注射，给予对照组大鼠静脉注射等量生理盐水，各组大鼠均每3 d注射一次。分别给予小、中、大剂量组大鼠黄芪甲苷40 mg·kg-1、80 mg·kg-1和160 mg·kg-1灌胃，在对照组，给予等量生理盐水灌胃。连续40 d后，称量大鼠体质量，经眼眶取血，经离心分离血清。取肝组织，置入4%多聚甲醛溶液中固定，常规行病理学检查；另取肝组织，经研磨、匀浆。

1.3 检测指标 包括肝组织匀浆SOD、GSH和MDA含量、血生化和血清Hyp含量。

1.4 肝细胞凋亡检测 采用TUNEL法，取石蜡切片，按照TUNEL检测试剂盒说明书操作，每组随机选择5个视野，计数凋亡小体，取均数。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，采用one-way ANOVA检验，对方差齐性者，采用LSD分析，对方差不齐者，采用Games-Howell检验。应用Graphpad Prism 5.0软件绘图，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织匀浆SOD、MDA和GSH水平比较 模型组大鼠SOD含量显著低于对照组（P＜0.05），而小、中、大剂量黄芪甲苷处理组大鼠血清SOD含量均显著高于模型组（P＜0.05）；模型组大鼠MDA含量显著高于对照组（P＜0.05），而小、中、大剂量黄芪甲苷处理组大鼠MDA含量均显著低于模型组（P＜0.05）；模型组大鼠GSH含量显著低于对照组（P＜0.05），而小、中、大剂量黄芪甲苷处理组大鼠GSH含量均显著高于模型组（P＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠肝组织匀浆SOD、GSH和MDA（±s）比较

表1 各组大鼠肝组织匀浆SOD、GSH和MDA（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

SOD（U/mg） GSH（U/mg） MDA（U/mg）对照组 10 100.15±8.81 20.84±0.83 8.06±1.52模型组 10 67.47±7.34① 9.03±0.75① 20.88±1.05①小剂量黄芪 10 72.36±7.25② 23.39±0.71② 18.46±0.85②中剂量黄芪 10 79.36±7.36② 25.52±1.23② 15.29±0.93②大剂量黄芪 10 89.25±7.14② 27.67±1.38② 11.47±2.05②只

2.2 各组大鼠血生化指标比较 见表2。

表2 各组大鼠血生化指标（±s）比较

表2 各组大鼠血生化指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

只 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） ALB（g/L）对照组 10 33.25±12.32 103.25±14.25 13.72±3.09 38.42±4.75模型组 10 86.52±21.23① 216.33±45.21① 31.23±2.10① 34.52±3.10①小剂量黄芪 10 49.36±10.34② 141.25±45.33② 25.92±2.10② 38.51±1.20②中剂量黄芪 10 41.36±11.42② 115.17±26.15② 23.83±3.11② 38.56±2.03②大剂量黄芪 10 39.65±17.25② 99.56±15.14② 23.65±2.13② 38.12±2.03②

2.3 各组大鼠血清Hyp含量比较 小、中、大剂量黄芪甲苷处理组大鼠血清Hyp含量分别为（20.1±3.05）μg/g、（19.36±5.14）μg/g和（19.16±3.13）μg/g，均显著低于模型组[（27.83±2.56）μg/g，P＜0.05]，而与对照组比无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠肝组织病理学改变情况 模型组大鼠肝组织细胞索紊乱、细胞水样变性、炎症细胞浸润；与模型组比，黄芪甲苷处理组大鼠肝组织损伤改善（图1）。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（H&E，200×）

2.5 各组大鼠肝组织细胞凋亡情况 对照组大鼠肝组织切片中几乎不可观察到凋亡小体，其相应凋亡小体个数为（17.23±3.08）个；相比较于对照组，模型组大鼠肝组织切片中凋亡小体显著增多，其凋亡小体个数为（66.54±2.56）个；黄芪甲苷低、中及高剂量组大鼠凋亡小体个数均显著低于模型组（P＜0.05，图2A和2B）。

图2 各组大鼠肝组织细胞凋亡情况

3 讨论

当CCL4进入机体后被肝脏微粒色素P450激活，形成的三氯甲基和氯自由基能与肝细胞溶酶体、微粒体、内质网的脂蛋白结合，诱导产生脂质过氧化作用，从而导致肝损伤[9，10]，本研究在模型组大鼠血清ALT和AST显著升高，肝组织学表现为肝损伤，证实肝损伤模型制备成功。黄芪甲苷处理组大鼠血清ALT和AST水平显著降低，肝组织学损伤改善。

在CCL4诱导的肝损伤大鼠，模型组大鼠血清白蛋白水平明显低于对照组，这是因为在肝损伤时，白蛋白的合成、细胞内运输和释放均发生障碍，引起血清蛋白减少[12]。相比于模型组，黄芪甲苷处理组大鼠血清白蛋白水平显著升高，说明黄芪甲苷能有效调节肝损伤大鼠蛋白合成功能。肝细胞受损后其摄取、结合胆红素的能力及毛细胆管排泄胆红素的能力下降，导致血清胆红素水平升高[13]。因此，胆红素水平可以作为反映肝脏生化功能的指标之一，可用于判定肝脏损伤程度。有研究表明，机体正常生理浓度的胆红素具有很好的抗氧化作用，可有效从多方面保护细胞受损[14，15]。研究证实，在肝损伤状态下胆红素在体内积蓄，而失去抗氧化作用，且随着血清胆红素水平的升高，肝脏损伤程度变得严重。在本研究，经黄芪甲苷处理的大鼠血清胆红素水平显著降低，说明黄芪甲苷能在一定程度上促进肝细胞对胆红素的代谢，在一定程度上减轻了肝损害的不利因素。Hyp既是胶原蛋白形成的主要成分，也是判断肝损伤及早期肝纤维化的重要指标。在黄芪甲苷干预后，给药组大鼠血清Hyp含量显著降低，也说明黄芪甲苷能通过降低肝组织Hyp含量实现对肝损伤的保护作用。

肝损伤往往伴随着脂质过氧化过程的发生，相应的脂质过氧化产物如活性氧自由基和MDA等也会增加，其中MDA含量常被用于评价脂质过氧化程度，也可以间接地作为细胞氧化损伤的评价指标[16]。SOD活力维持在正常水平是保护肝脏功能所必须的，对预防、修复氧化应激引起的肝损伤具有重要的作用，SOD活力能反映机体清除活性氧自由基的能力[17]。GSH是一种低分子自由基清除剂，可清除O2、H2O2、LOOH，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S转移酶两种酶类的底物，为两种酶分解过氧化物所必须的原料[18]。因此，肝组织GSH含量在一定程度上可用于评价肝损伤受到氧化应激和脂质过氧化损伤的程度[19]。MDA、SOD和GSH三项指标的测定常相互配合，用于评价机体氧化应激和抗氧化应急系统平衡，或这种平衡造成的氧化损伤状态[20]。本研究发现，应用黄芪甲苷能有效提升CCL4致肝损伤大鼠肝组织GSH和SOD活性，减少MDA的生成，证实黄芪甲苷能有效改善肝组织的氧化应激及脂质过氧化损伤的程度。

病理学检查结果显示，肝损伤大鼠肝组织可见明显的细胞索紊乱、细胞水样变性、炎症细胞浸润，在予以大鼠黄芪甲苷干预后，给药组大鼠的上述病理学表现得到明显改善。在小鼠体内实验也证实黄芪甲苷对肝损伤具有很好的改善作用[21]，与本研究结果一致。经TUNEL染色发现肝损伤会引起肝组织细胞发生明显的凋亡，而给药组大鼠肝组织细胞凋亡数明显低于模型组，说明黄芪甲苷对肝损伤所致的细胞凋亡有一定的抑制作用。