长链非编码RNA BDNF-AS在乳腺癌中的表达及作用

吴多明 武力 张晓斌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，病死率位居第4 位，并呈现逐年上升的趋势。目前，治疗乳腺癌的手段主要包括手术、化疗和放疗，但很多机制仍未阐明。近年来，基因治疗发展成为诊疗肿瘤的研究热点，探寻与乳腺癌相关的抑癌基因和促癌基因为乳腺癌的诊治提供了新的研究方向［1］。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA。研究报道，多种lncRNA在乳腺癌的发生、发展中起着重要的作用［2］。lncRNA 脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）-AS是BDNF的天然反义转录物。生物信息学分析发现，乳腺癌组织中47个lncRNA表达具有显著性差异，其中lncRNA BDNF-AS表达显著下调［3］。BDNF与乳腺癌发病、预后和耐药等密切相关［4］，因此，探讨lncRNA BDNF-AS在乳腺癌发生、发展中具有重要意义。本研究旨在通过检测乳腺癌患者的癌组织与癌旁正常组织中的BDNF-AS表达差异，探讨BDNFAS对乳腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本收集 随机选取2016年1月至2018年12月88例于兰州大学第一医院行乳腺癌手术切除患者的组织标本，均经病理学确诊，术前未行放、化疗等任何治疗，标本中的癌旁组织距癌组织5 cm 左右。本研究由兰州大学第一医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.1.2 细胞和试剂 正常人乳腺细胞系HBL-100和人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3购于美国模式培养物保藏所细胞库。培养基和胎牛血清购于美国BI公司。Trizol、RNA提取试剂盒和反转录试剂购于山东宝生物工程有限公司。lncRNA BDNF-AS、BDNF 和β-actin 引物、pcD⁃NA3.1、pcDNA3.1-BDNF-AS 和LipofectamineTM2000由广州锐博生物科技有限公司设计合成和提供。MTT、Caspase-3 活性检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术公司。一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin和BDNF）和羊抗鼠二抗购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3）及正常乳腺细胞HBL-100使用10%胎牛血清和高糖DMEM培养基培养，MCF-7细胞使用10%胎牛血清和RPMI 1640培养基培养，均在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 细胞接种于培养板中，待细胞汇合至60%～70%，使用脂质体LipofectamineTM2000 包载pcDNA3.1-BDNF-AS 转染至MDA-MB-231 细胞内。通过RT-qPCR检测BDNF-AS表达，评价其转染效率。

1.2.3 MTT 法检测 细胞在培养箱中培养至所需时间（0、12、24和48 h）后，加入MTT 溶液反应4 h，吸弃培养基，加入DMSO 溶解，490 nm波长下检测OD 值，反映细胞活性。

1.2.4 比色法检测Caspase-3 活性 提取细胞裂解液中总蛋白，并测定浓度。参照试剂盒说明书配制反应体系，37℃孵育2 h，405 nm波长下检测OD值。

1.2.5 EdU 检测细胞增殖能力 细胞培养板中加入EdU 渗入工作液，继续培养3 h 后，经4%多聚甲醛固定，加入0.5%TritonX-100 打孔，再加入染色液孵育30 min，DAPI染核。于荧光显微镜下拍照，蓝色为细胞核，绿色为EdU 阳性细胞即新增殖的细胞，计算EdU 阳性率，反映细胞增殖能力。EdU 阳性率=EdU阳性细胞数/DAPI染色的总细胞数。

1.2.6 RT-qPCR 检测lncRNA BDNF-AS表达组织或细胞经Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA，使用ABI-7300PCR 仪进行扩增和检测，并分析计算其表达量。引物序列如下：BDNF-AS 上游为5'-AGCC ATGTGACTGATCTTCG-3'，下游为5'-GGAGCCAAC AAACAACTGGT-3'；BDNF 上游为5'-AAACATCCG AGGACAAGGTG-3'，下游为5'-AGAAGAGGAGGCT CAAAGG-3'；β-actin 上游为5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，下游为5'-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3'。

1.2.7 Western blot 检测蛋白表达 刮取培养板中细胞，3 000 rpm/min，离心60 min后收集蛋白裂解液，吸取上清，加入上样缓冲液，99℃变性，蛋白浓度由BCA蛋白测定试剂盒测定，并计算20 μg总蛋白对应的上样体积。将蛋白湿转至PVDF 膜上，在4℃下使用一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin 和BDNF）孵育过夜，TBST漂洗，加入二抗室温孵育1 h，TBST漂洗，显影。

1.2.8 细胞划痕实验 将MDA-MB-231细胞接种在6孔板中，待细胞融合度达100%时，使用移液器头垂直划出3个间隔，置于含不同干预因素的无血清培养基中培养。于0、24和48 h分别拍照，比较划痕宽度。

1.2.9 Transwell细胞侵袭实验 将MDA-MB-231细胞接种于未涂Matrigel的Transwell小室，继续培养24 h后，棉签擦净未迁移的细胞，结晶紫染色，显微镜下计数每一视野内穿过膜的细胞数目。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析one-way ANOVA 比较多组间差异，采用t检验比较两组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌患者癌组织和乳腺癌细胞系中的表达

88 例乳腺癌患者的癌旁组织较癌组织中ln⁃cRNA BDNF-AS 表达下调（图1A），与正常的乳腺细胞相比lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌细胞系中表达下调，其中在MDA-MB-231 细胞中下调最显著（图1B）。因此，后续lncRNA BDNF-AS 过表达的细胞功能检测选择在MDA-MB-231细胞完成。

图1 乳腺癌组织和细胞系中lncRNA BDNF-AS的表达

2.2 乳腺癌患者组织中lncRNA BDNF-AS 表达与临床病理特征关系

以乳腺癌患者lncRNA BDNF-AS 的平均表达水平为cut-off 值，分为低表达43 例和高表达45 例。BDNF-AS 的表达与TNM 分期（P＜0.05）和淋巴结转移（P＜0.05）呈负相关，但与年龄、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）无关（P＞0.05，表1）。

2.3 过表达lncRNA BDNF-AS 对乳腺癌细胞增殖的影响

与空白质粒pcDNA3.1比较质粒pcDNA3.1-BDNFAS可过表达lncRNA BDNF-AS（图2A），过表达lncRNA BDNF-AS可降低MDA-MB-231细胞活性（图2B），且减少EdU 阳性细胞数（图2C、D），表明过表达lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌细胞增殖。

2.4 过表达lncRNA BDNF-AS 对乳腺癌细胞凋亡影响

过表达lncRNA BDNF-AS可显著增加Caspase-3的活性（图3A），并下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达（图3B、C），表明过表达lncRNA BDNF-AS 可促进乳腺癌细胞凋亡。

表1 88例乳腺癌患者组织中lncRNA BDNF-AS表达与临床病理特征关系

2.5 过表达lncRNA BDNF-AS 对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

细胞划痕实验表明过表达lncRNA BDNF-AS 可抑制乳腺癌细胞迁移（图4A），Transwell 实验结果表明过表达lncRNA BDNF-AS 可抑制细胞侵袭（图4B），pcDNA3.1-BDNF-AS 可下调MMP-9 蛋白和上调E-cadherin 蛋白表达（图4C），进一步证实过表达lncRNA BDNF-AS抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

2.6 过表达lncRNA BDNF-AS对BDNF表达的影响

过表达lncRNA BDNF-AS 可显著抑制乳腺癌细胞中的BDNF mRNA 和蛋白的表达（图5），表明ln⁃cRNA BDNF-AS负性调控BDNF表达。

图2 质粒pcDNA3.1-BDNF-AS对lncRNA BDNF-AS表达和乳腺癌细胞增殖的影响

图3 质粒pcDNA3.1-BDNF-AS对乳腺癌细胞凋亡的影响

图4 质粒pcDNA3.1-BDNF-AS对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

图5 质粒pcDNA3.1-BDNF-AS对BDNF表达的影响

3 讨论

近年来，lncRNAs 在乳腺癌中的作用逐步被揭示［5-6］，如乳腺癌组织中的lncRNA HOTAIR 表达上调与乳腺癌的分化程度和转移密切相关，lncRNA HO⁃TAIR可诱导乳腺癌细胞侵袭［7］。本课题组前期研究发现，在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中lncRNA GASL1表达水平下调，lncRNA GASL1抑制MCF-7细胞的增殖，促进其凋亡［8］。此外，本课题组还发现在乳腺癌组织中lncRNA AFAP1 AS1 表达上调与肿瘤恶性程度和预后密切相关［9］。

有研究报道，在结肠癌、宫颈癌和食道癌癌组织中lncRNA BDNF-AS 表达下调，参与癌细胞的增殖、迁移和侵袭［10-12］。本研究发现，相比乳腺癌患者癌旁组织，癌组织中lncRNA BDNF-AS 表达显著下调，进一步分析lncRNA BDNF-AS 表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的相关性发现，癌组织中lncRNA BDNF-AS 表达与TNM分期和淋巴结转移呈负相关，提示lncRNA BDNF-AS 可能参与乳腺癌的发生、发展。此外，在乳腺癌细胞株和正常乳腺细胞中，本研究检测lncRNA BDNF-AS的表达发现，在乳腺癌细胞中lncRNA BDNF-AS 表达显著低于正常乳腺细胞。为确证lncRNA BDNF-AS在乳腺癌中的作用，进一步探讨lncRNA BDNF-AS 对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，发现过表达lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进凋亡，表明lncRNA BDNF-AS对乳腺癌具有抑癌作用。

lncRNA BDNF-AS 属于反义lncRNA。反义ln⁃cRNA 是一类从蛋白或非蛋白编码基因的相反链上转录而来的lncRNA，常与编码蛋白的基因完全或部分互补。研究表明，反义lncRNA 可能通过特殊的二级结构以及抑制翻译过程等作用机制负向调控正义基因的表达［13-14］。lncRNA BDNF-AS 的正向基因为BDNF，在乳腺癌组织中BDNF高表达，并与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发、生存期短和预后不良相关［9］。因此，本研究进一步观察乳腺癌细胞中lncRNA BDNF-AS 对BDNF 的调节作用，发现过表达lncRNA BDNF-AS 可抑制BDNF 表达。有研究发现，视网膜母细胞瘤中BDNF-AS通过下调BDNF抑制细胞周期转换，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期［15］。基于上述研究，本研究推测lncRNA BDNF-AS 可能通过依赖于BDNF的下游信号分子负性调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。

综上所述，本研究发现lncRNA BDNF-AS表达与乳腺癌恶性程度和转移相关，其在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中均表达下调。lncRNA BDNF-AS 促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制凋亡，其机制与上调BDNF 表达相关。lncRNA BDNF-AS 可能会成为乳腺癌诊断的新型生物标志物和防治乳腺癌的新靶点。