正交试验联合CCD-RSM优化湿热消颗粒中总黄酮提取工艺研究*

梁国成,陈舒茵,黄小鸥,方建康,冯文勇,覃 翔,黄 敏,荀建宁

1.广西中医药大学附属瑞康医院(南宁530011)；2.广西大学(南宁 530004);3.广西中医药大学第一附属医院(南宁530023)

正交试验是目前国内较为常用的用于研究中药复方成分的提取工艺的试验设计方法，采用的是线性的数学模型进行优化[1-2]；星点设计(Central composite design,CCD)是一种公认的较为科学的实验设计方法，在国外应用较广，其主要是基于非线性的数学模型的拟合，是一种多因素多水平优化设计的方法，试验数据的处理可用三维效应面(Response surface)进行，再此基础上以非线性方程拟合，即试验预测的结果可在模拟方程的基础上较好地得到反映[3]。效应面优化法(Re-sponse surface methodology)亦是国外流行的一种通过实验而寻求最优条件的试验方法，较多用于非线性数据的处理，此法即通过回归方程的拟合，绘制相应的响应曲面和等高线，通过比较各实验数据即可简便快速的得到各数值相应的响应值，从而得到预测的响应最优值，以及相应的实验条件[4]。

慢性前列腺炎(Chronicprostitis，CP)是临床上常见的男性科疾病之一，相关数据显示，所有男性科疾病当中，CP占比达1/3，且发病年龄以20岁至40岁年龄段的青中年居多，超过50%的男性均出现过不同程度的CP症状[5]。湿热消颗粒是根据广西中医药大学附属瑞康医院男性科名老中医的验方改剂型而制成，由金钱草，丹参，虎杖等中药组成，具有清热利湿、活血消炎的作用，能有效防治CP[6-8]，但关于湿热消颗粒防治CP的药效作用物质基础及其总物质的研究未见报道。现代药理研究证实，总黄酮为防治CP的有效成分之一[9-11]，处方中金钱草、厚朴、丹参及虎杖等均含黄酮类成分，笔者尝试采用正交试验联合星点设计-效应面法研究其总黄酮的提取工艺。

资料和方法

1 仪 器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，L6紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)。

2 试剂与试药 湿热消颗粒处方药材均购自广西德润堂中药科技有限公司，槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，100081-201610，含量测定用)，乙醇(南京化学试剂股份有限公司，分析纯)，无水乙醇(广东翁江化学试剂有限公司，分析纯)，AlCl3(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，NaCH3COOH(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)，纯化水(自制)。

3 研究方法

3.1 对照品溶液的制备： 取适量槲皮素对照品，精密称定为10.07 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取25 ml至50 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度线，摇匀，即得。

3.2 供试品溶液的制备： 取处方量药材10 g，按各试验条件设计进行提取，合并提取液，过滤，定容至1000 ml容量瓶，精密量取10 ml供试液，蒸干，精密加入70%乙醇10 ml，定容，超声1 h，补足损失，过滤，移至10 ml容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度线，混匀备用。

3.3 最大吸收波长的考察： 分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各1 ml，置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加热，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反应2 min后取出，用70%乙醇定容，摇匀，待溶液温度降至室温[12]，以相应试剂为空白，在200～500 nm波长范围进行扫描。结果显示，槲皮素对照品溶液与供试品溶液的最大吸收波长均位于442 nm处，且光谱图基本一致，最终选择检测波长为442 nm。

3.4 线性及线性范围的考察： 精密量取槲皮素对照品溶液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml分别置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加热，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反应2 min后取出，用70%乙醇定容，摇匀，待溶液温度降至室温，以相应试剂为空白，紫外-可见分光光度计于442 nm处测量吸光度值，绘制标准曲线，以吸光度A为纵坐标(Y)，槲皮素含量(mg)为横坐标(X)，回归方程为Y=10.395X+0.067，R2=0.9996。

3.5 精密度试验：精密吸取“供试品溶液的制备”项下供试品，在442 nm波长下，连续测定5次，其吸光度的RSD%=0.85%，表明精密度良好。

3.6 稳定性试验： 精密吸取“供试品溶液的制备”项下供试品，在442 nm波长下，分别于0，1，2，4，8，12 h测定，测定6次，其吸光度的RSD%=0.79%，表明在测定时间(12 h)内供测定样品的稳定性良好。

3.7 重现性试验：取5份湿热消颗粒(同一批次)，分别按“供试品溶液的制备”项下平行制备供试品溶液，依法进行操作及测定，吸光度的RSD%=1.15%，表明本操作及检测方法重现性良好。

3.8 回收率试验：取5份供试品(已知含量)并精密称定，分别精密加入槲皮素对照品，照“供试品溶液的制备”项下操作，依法测定吸光度并计算总黄酮的含量，结果平均回收率为92.82%，RSD%=2.76%。

3.9 总黄酮的回流提取工艺操作： 准确称取适量处方量药材(事先经60℃下干燥2 h)，以规定量浓度的一定量乙醇浸泡0.5 h，加热沸腾煎煮至规定的时间，滤取药液后依法再进行煎煮，再滤取药液，与前次所得药液合并，浓缩、干燥，称取干膏量(g)并测定其中总黄酮含量(mg/g)，以干膏量及总黄酮含量为指标，优选影响结果的各关键工艺参数。

3.10 正交试验设计：影响提取工艺的关键因素通常有：提取所用乙醇的浓度(%)、每次提取用溶剂的用量(倍)、沸腾提取的时间(h)和提取的次数(次)，故本试验就此四者，进行L9(34)正交试验考察。

表1 总黄酮提取工艺因素水平表

结 果

试验结果可直观分析得到，以干膏得量(g)为观察指标时，A因素和C因素均对本试验提取工艺过程产生有显著影响，通过对比考察的各因素影响主次分别为：A>C>B>D，即乙醇浓度>提取时间>溶剂用量>提取次数；直观分析得知，各因素中：A2>A3>A1，B3>B1>B2，C3>C2>C1，D3>D2>D1，即组合为A2B3C3D3。

以总黄酮含量(mg/g)为指标时，A因素对本试验提取工艺过程产生有显著影响，通过对比考察的各因素影响主次为：A>B>C=D，即乙醇浓度>溶剂用量>提取时间=提取次数；直观分析得知，各因素中：A3>A2>A1，B3>B1>B2，C1>C3>C2，D2>D1>D3，即组合为A3B3C1D2。

据综合表3直观分析结果及综合考虑各因素对提取的贡献率以及能源损耗与工艺耗时等因素，在干膏中总黄酮含量相差不大的情况下，以干膏得量为主要指标。综上所述，最佳提取工艺组合为A2B3C3D2，即用12倍量的60%乙醇提取2次，每次提取2 h。

表2 总黄酮提取工艺试验结果

表3 总黄酮提取工艺直观分析结果

表4 总黄酮提取工艺干膏得量方差分析结果

表5 总黄酮含量方差分析结果

注：F0.01(2,2)=99.0；F0.05(2,2)=19.0；F0.10(2,2)=9.0

1 提取工艺验证 准确称取3批处方量药材(已于60℃下干燥2 h)，以12倍量乙醇(60%浓度)浸泡0.5 h，沸腾提取2次，每次2 h，滤取药液后合并2次提取液，浓缩、干燥，称取干膏得量并计算其总黄酮含量，结果平均干膏得量为12.0639 g，RSD=2.17%；平均总黄酮含量为35.1558 mg/g，RSD=1.01%。证实所选工艺稳定、可靠。

2 星点设计-效应面法试验设计及结果 因提取次数为非连续性的，而星点设计试验各因素应是连续性的，故本次试验暂定提取次数为2次，考察乙醇浓度(A)、溶剂用量(B)和提取时间(C)，以干膏得量与总黄酮含量为指标，综合评分。根据正交试验数据基础和星点设计试验的原理，每因素设置5水平，各因素极大、极小水平值根据预试验结果设立，代码分别为±α，±1，0，再遵循“任意两个物理量之间的差值与对应代码之间的差值呈等比关系”的原则安排试验的水平，通过建立相关的模型拟合效应及因素，进而可以直观地描绘得到三维效应面，最后可从较优的效应面区域中快速地读取本次试验最佳的工艺条件[13]。采用Design Expert 10.0.7软件安排实验，试验设计与结果见表6～8。

采用多元线性模型对各影响因素和指标进行回归计算，方程为R1=+88.73+5.56×A+4.38×B+1.29×C(R2=0.6816，P<0.05)。采用二次多项非线性模型对各影响因素和指标进行回归计算，方程如下：R1=+96.76678+5.55837×A+4.38024×B+1.28578×C+2.36625×A×B+0.053750×A×C+0.84875×B×C-5.50696×A2-4.14754×B2-2.12168×C2(R2=0.8324，P<0.01)

采用Design Expert 10.0.7软件绘制模型中任意两因素对各评价指标的效应面图和等高线图，分析结果可知，多元线性回归模型拟合度不佳，预测性不理想。对各因素进行二次多项式拟合，方程拟合度良好，表明模型能较好且误差较小的反映响应值的变化，且具有显著影响，可较好的对提取工艺进行分析和预测。预测的三因素的最优条件所在区域为：A：60%～70%，B：11～12倍量，C：105～115min；考虑到生产实际情况，对实验结果进行了微调，最终优选的处方为A(乙醇浓度)为以11倍量65%乙醇进行提取2次，每次110 min。

表6 总黄酮提取工艺星点设计因素及水平表

表7 总黄酮提取工艺星点试验设计与结果

表8 二次多项回归方程方差分析结果

注：*P<0.05，△P<0.01， ◇P<0.0001

处方验证：根据优化出的处方，依法制备了3批样品，进行验证，并以公式“偏差=(预测值-实际值)/预测值×100%”计算偏差[14-15]，结果实际值和预测值偏差绝对值均小于5%，表明试验所得到的结果达到预期目的。

讨 论

正交试验设计是目前国内比较成熟的、用于研究多因素、多水平的一种高效、快速、经济的试验设计方法，能够极大的减少试验次数且不会降低试验的可行性，其根据试验的正交性，从整体试验过程中，有针对性的选择部分有代表性的试验点进行试验比较，所选的试验点具有“均匀分散，齐整可比”的特点。正交表是将预试验中所选的影响试验的各水平和因素组合排列成相应的表格，开始由日本著名的统计学家田口玄一提出，经广泛的应用证实，其能够极大程度的减少试验次数，减少试验的工作量，为广大科研工作者所接受和采用，现已广泛应用于生产和科研等很多领域的研究中[16-17]。

星点设计-效应面法是国外常用的用于优化非线性拟合试验设计的方法，采用归一化几何平均数法处理数据，能够消除各个评价指标单位或量纲不同所引进的不确定因素，预测能力强、精度高[18-19]，且利用对应软件建立模型，绘制三维效应曲面关系图，并可旋转，能够更好、更直观的解决目前国内正交试验设计等方法试验精度不够、不能灵敏的体现各因素间交互作用等缺点[20]。本试验通过星点设计-效应面法优选最佳取值区域，并选取最优工艺参数进行实验验证，结果表明该组数据带入最佳模型方程获得的理论预测值与实测值比较吻合，证实所建立的数学模型具有较好的预测性，表明采用星点设计-效应面法优化本制剂中总黄酮的提取工艺，达到实现多指标同步优化的目的是可行的。