补肺汤对慢性阻塞性肺疾病肺气肿大鼠血清IFN-γ、IL-4表达水平影响研究*

王珊珊,谭光波

1.湖南中医药大学(长沙 410208)；2.湖南省中医药研究院附属医院(长沙 410006)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstruetive pulmonary diseases，COPD)是一种全球范围内广受关注的慢性疾病和主要的死亡原因[1]，目前是第4位死因[2]。肺气肿是慢性阻塞性肺疾病最为重要的病理改变之一，当其进行性发展到一定的严重程度时，会成为COPD气流受限中的主导因素[3]。中医学中并没有关于COPD肺气肿的记录，但据它的临床症状表现及特征，现在基本将其归于“喘证”、“肺胀”、“咳嗽”等范围[4]。近年来，随着中医药事业的发展，中医药治疗COPD肺气肿也越来越得到广泛的关注。有实验研究发现[5]，COPD肺气肿实验动物模型存在肺气虚症状表现，这与其病因病机有一定的相关性[6]，本实验采用经典补气方药补肺汤对COPD肺气肿模型大鼠进行治疗，观察补肺汤对COPD肺气肿的疗效和可能存在的作用机制，为临床运用补肺汤治疗COPD肺气肿提供依据。

材料和方法

1 实验动物 本次实验动物均为清洁级健康SD大鼠，共40只，性别均为雄性，鼠龄为7周，体重(200±20)g，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。

2 实验药物 脾氨肽口服冻干粉，2 mg/瓶，浙江丰安生物制药有限公司(国药准字H10970214)。补肺汤免煎颗粒(由黄芪30 g，人参、紫菀各10 g，熟地黄20 g，桑白皮15 g，五味子5 g组成)；由湖南省中医药研究院附属医院中药房提供。脂多糖，购自成都康斯坦科技有限公司，由美国Sigma公司生产。相思鸟牌香烟(烟气中一氧化碳含量14 mg，焦油量13 mg，尼古丁含量1.1 mg)，由湖南中烟工业有限责任公司生产。

3 实验设备与试剂 摇床：其林贝尔TS-92；恒温箱北京六一DYY-6C；微波炉：美的MM721AAU-PW；切片刀莱卡M199；切片机：浙江金华益迪试验器材YD-315；包埋机：常州中威电子仪器BMJ-A；普通冰箱：荣事达BCD-245F；精密pH计：雷磁E-201-C；显微镜：MoticBA210T；盖玻片：海门远泰DY89-1；载玻片：海门远泰AY89-2；常规化学试剂：上海国药生物；石蜡：Sigma；中性树胶Sigma；苏木素PBS(7.2-7.6)Sigma。大鼠IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。

4 造模及分组给药 40只清洁级健康SD大鼠随机分成四组：空白对照组、模型组、西药对照组，中药治疗组，每组10只，模型组、西药对照组、中药治疗组均予以气道内注射脂多糖加被动烟熏建立COPD肺气肿动物模型[7]，将大鼠置密闭烟熏箱内，予相思鸟牌香烟每次10支点燃后烟熏，2次/d，40 min /次，间隔 6 h，共 70 d。第 20、50 天使用水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，暴露气管，气道内注入脂多糖 200 μl(1 g /L) ，旋转固定板，使脂多糖均匀分布两肺。空白对照组置于同样密闭箱，于第 20、50天气管内注入等量生理盐水，不予以被动吸烟。空白对照组和模型组于造模成功后第2天给予生理盐水灌胃(5 ml/只)，中药治疗组给予补肺汤免煎颗粒冲兑灌胃(每剂冲兑为100 ml，稀释至5 ml/只)，西药对照组给予脾氨肽口服冻干粉灌胃(2 mg予生理盐水10 ml稀释，5 ml/只)，2次/d，共14 d。

5 标本的收集和检测 水合氯醛(2 ml/kg)腹腔麻醉给药后开腹，下腔静脉采血后分离血清，按照IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒使用说明书检测血清IFN-γ、IL-4的含量。用手术刀切取大鼠右肺下叶组织，投入4%多聚甲醛溶液中固定常规脱水，石蜡包埋、切片，予HE染色，观察病理形态改变。

6 统计学方法 使用SPSS 22.0统计学软件包进行统计。采用WPS Office绘制ELISA标准曲线，求出样本浓度；计量数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的统计方法，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠病理学变化比较 实验肺组织病理切片在HE染色后于光镜下进行病理学观察，观察图像经过比较后显示：空白对照组大鼠的肺泡，血管，支气管均未见异常，肺泡大小基本正常，且形状规则，偶有断裂，考虑在制作切片时人为物理因素所导致。西药对照组、中药治疗组与模型组的肺内肺泡管，肺泡囊，肺泡，细支气管与对照组相比均明显扩大，肺泡壁变薄并且有多处断裂，相邻肺泡相互融合成较大的肺大庖。但西药对照组、中药治疗组较模型组相比，上述病变有所减轻(图1)。

图1 各组大鼠病理学变化(HE染色×100 )

2 各组大鼠血清中IFN-γ、IL-4含量变化 血清中IFN-γ、IL-4炎性因子的水平最终检测标本40例，其中空白对照组、模型对照组、西药对照组、中药治疗组各10例。

与空白对照组相比,模型组血清中IFN-γ含量明显减少(P<0.01)；与模型组相比，中药治疗组血清中 IFN-γ含量均明显增高(P<0.01)，见表1。与空白对照组相比,模型组血清中IL-4含量明显增高(P<0.01)；与模型组相比，中药治疗组血清中IL-4含量均明显减少(P<0.01)，见表2。与西药对照组相比，中药治疗组血清中IFN-γ、IL-4的含量均无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清中IFN-γ浓度(pg/ml)

注：模型组与空白对照组相比，*P<0.01；其余组与模型组相比， #P<0.01

表2 各组大鼠血清中IL-4浓度(pg/ml)

注：模型组与空白对照组相比， *P<0.01；其余组与模型组相比， #P<0.01

讨 论

补肺汤出自《永类钤方》，主治肺虚咳喘、气短咳嗽等证，具有补肺益气，止咳平喘之效[8]。全方由人参、黄芪、熟地黄、桑白皮、五味子、紫菀等6味药物组成。人参，归肺、脾、心经，其功效大补元气，补脾益肺。久病肺虚是COPD肺气肿的发病基础[9]，可予以人参治其本。肺气虚，通调水道失职，可见痰涎壅盛，COPD肺气肿常见咳嗽咳痰等症状，脾为肺之母，“虚则补其母”，脾主运化，健脾可化湿。黄芪归脾、肺经，其功效健脾补肺，益卫固表[10]，黄芪与人参相须为用，肺脾同补可治疗COPD肺气肿之标本。熟地黄具有补血养阴，填精益髓之功效，因为肾为肺之子，肾精充足则喘停咳止。方中桑白皮可清泻肺火而兼泻肺中水气；五味子收涩补肾，益气生津，上能敛肺气，下能滋肾阴；佐以紫菀润肺化痰止咳。诸药合用，全方共奏补肺益肾，纳气平喘，止咳化痰之功，而方主以补肺气为要。现代多项研究也证实补肺汤对COPD肺气肿患者有改善症状、增强免疫力等作用。王朝兰等[11]的实验表明补肺汤可能是通过增加模型大鼠的免疫功能、抑制炎症因子释放、减轻肺与支气管的病理学改变达到补益肺气的目的。于河安等[12]的临床研究表明，补肺汤对COPD肺气肿患者具有良好的疗效，能够有效地改善患者的生活质量，有利于患者病情的稳定和改善。有研究表明[13]，补肺汤可能通过调节Th1/Th2的失衡，达到调节大鼠免疫功能的目的。

目前学界对关于影响COPD肺气肿发生和发展可能存在作用机制并没有完全统一的意见，一直以来弹力蛋白酶-抗弹力蛋白酶、慢性炎症、氧化应激等学说占据主流地位[14]。但是近年来随着越来越多的广泛实验研究和临床观察，T细胞介导的获得性免疫可能参与了COPD肺气肿的疾病发生发展过程的讨论也得到了研究者们的重视[15]。Thl/Th2失衡极其可能在COPD肺气肿发生发展中的占据重要的作用。到现在为止，大量的研究并没有发现和Th1与Th2相关的具有特异性细胞表面标志，所以学者都选择通过其所分泌的细胞因子的不同来对Th1及Th2进行区分和鉴别。Th1分泌的IFN-γ及Th2的释放IL-4，都参与了机体自身的免疫反应[16]。

本实验采用气道内注射脂多糖联合被动烟熏的方式建立COPD肺气肿大鼠模型。实验中模型组大鼠肺组织HE染色切片在光镜下病理改变明显，与相关报道一致，提示本次实验建立的COPD肺气肿大鼠模型成功[17]。临床上关于补肺汤治疗COPD肺气肿有广泛应用。本次试验研究结果提示，补肺汤具有改善周围气道壁损伤及不规则修复，减轻肺泡扩张及病理性融合的作用。补肺汤对能增加COPD肺气肿大鼠血清中IFN-γ的分泌，减少血清中IL-4的分泌，其作用机理可能与调节Th1/Th2细胞因子的平衡有关。

综上所述，中医经典方剂补肺汤可能能够通过减少血清中IL-4的生成和促进IFN-γ的表达来维持Thl细胞与Th2细胞之间的动态平衡，起到良好的抗炎和调节免疫作用，减轻肺泡扩张及病理性融合，但其最终并不能阻止COPD肺气肿的形成，其机制仍需要大量的动物实验及临床观察来进行进一步研究。