重组球形脂联素对糖尿病小鼠心肌细胞自噬和内质网应激水平的影响

宋英伦,郭志新,杨李莉,冯劲宜,石文姣

(山西医科大学第二医院内分泌科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:zhxguo1966@163.com)

糖尿病性心肌病是糖尿病常见的慢性并发症之一,是导致糖尿病患者致死致残的主要原因之一[1]。研究发现,内质网应激水平增高和自噬水平降低与糖尿病心肌病的发生、发展密切相关[2,3]。脂联素是脂肪细胞分泌的蛋白质,具有抗炎、抗糖尿病和抗动脉粥样硬化作用。研究发现,脂联素对糖尿病心脏具有保护作用[4,5],其作用机制目前尚不清楚。脂联素是否通过调节自噬和内质网应激对糖尿病心脏产生保护作用,目前国内外罕见报道。本研究旨在观察Ⅰ型糖尿病小鼠心肌组织内质网应激及自噬水平的变化,探讨重组球形脂联素是否通过调节内质网应激和自噬对糖尿病小鼠心肌组织产生保护作用,为临床防治糖尿病性心肌病变提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

链脲佐菌素(购于美国Sigma公司),重组球形脂联素(购于武汉艾美捷科技有限公司),血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所),血清胰岛素检测试剂盒(购自天津安诺瑞康生物技术有限公司)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(购自瑞士罗氏公司),引物合成(购自上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 糖尿病小鼠模型的建立及分组

8周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级别,生产许可号scxk(晋)2015-0001)48只购自山西医科大学实验动物中心,体质量(20±2)g。在12 h照明12 h黑暗的中心屏障环境中饲养,通风好,温度、湿度适宜,自由饮水和进食。所有小鼠在上述环境中适应性喂养一周后,随机分为正常对照组(NC组,n=8)和糖尿病造模组(n=40)。造模组小鼠先禁食12 h,然后立即腹腔注射链脲菌素60 mg/kg(0.1 mmol/L,溶于pH 4.5无菌柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液),NC组腹腔注射等量柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液,每日1次,连续注射5 d,继续喂养1周后测随机血糖值≥16.7 mmol/L为造模成功[6]。共有24只小鼠造模成功,用随机数字表法将造模成功的小鼠分为糖尿病组(DM组,n=8),糖尿病低剂量脂联素干预组(低剂量组,n=8)和糖尿病高剂量脂联素干预组(高剂量组,n=8)。参照文献[7,8],低剂量组和高剂量组分别腹腔注射重组球形脂联素5 μg/(kg·d)和15 μg/(kg·d)。NC组和DM组给予等量生理盐水腹腔注射。实验经山西医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.3 标本采集

重组球形脂联素干预第8周末小鼠禁食10-12 h后称重,用10%水合氯醛0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉,腹主动脉采血留取血标本,用于血糖、血脂、胰岛素水平检测。采血后立即处死动物,迅速取出心脏组织。心脏组织用生理盐水冲洗干净,滤纸吸干水分后称重,计算心脏质量指数(心脏质量/体质量×100%)。取部分左室心肌组织用中性甲醛固定,用于HE染色。其余左室心肌组织迅速置入液氮中待组织冷冻完全后储藏于-70 ℃冰箱待用。

1.4 小鼠血液指标检测

葡萄糖氧化酶法检测血糖,酶偶联比色法测定血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG),酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清胰岛素。

血糖测定步骤:采血样于血糖试纸,用瑞特GM300血糖仪检测血糖。

血脂测定步骤:取试管若干,编号为空白管、标准管、测定管,分别加入血清、血脂标准液、蒸馏水、酶试剂应用液混匀,置于37 ℃水浴中保温，以空白管调零,在500 nm处比色,读取标准管及测定管吸光度,按照公式计算得出血脂水平。

血清胰岛素测定步骤:加入标准品、待测样品及生物素标记抗体温育,再加入辣根过氧化物酶标记的INS抗体温育,反应过后冲洗掉未结合部分,再加入底物反应,之后加入终止液使其转化为黄色。通过读取标准品吸光度值来绘制出标准曲线,并在标准曲线上反算出血清胰岛素浓度。

1.5 小鼠心肌组织形态观察

心肌组织用10%中性福尔马林固定,酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制成5 μm厚切片,HE染色,脱水透明封固,在光镜下观察小鼠心肌组织形态学改变。

1.6 实时荧光定量PCR法检测内质网应激指标GRP78、CHOP、Caspase-12和自噬指标p62、LC3、Beclin1 mRNA表达

用实时荧光定量PCR法测定。取50 mg心肌组织，用Trizol提取总RNA，逆转录成cDNA,用荧光定量PCR仪进行扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性20 s, 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次。50 μl PCR反应体系包括：25 μl SYBR(主要包括dTNP、10×缓冲液、rTaq DNA聚合酶及MgCl2)、1 μl引物、5 μl cDNA和19 μl去离子水。目的基因表达阳性的标本荧光定量扩增曲线呈S形，从荧光定量PCR仪系统中读取Ct值。以2-ΔΔCt表示样品中目的基因mRNA相对于对照组的表达量。基因引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primer sequences

基因上游引物序列 下游引物序列 引物长度(bp)GRP785′-ATGATGAAGTTCACTGTGGTGG-3′5′-CTGATCGTTGGCTATGATCTCC-3′174CHOP5′-CTCCAGATTCCAGTCAGAGTTC-3′5′-ACTCTGTTTCCGTTTCCTAGTT-3′80Caspase-125′-TGGCCCATGAATCACATCTAAT-3′5′-TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT-3′83LC35′-CCACCAAGATCCCAGTGATTAT-3′5′-TGATTATCTTGATGAGCTCGCT-3′120Beclin15′-TAATAGCTTCACTCTGATCGGG-3′5′-CAAACAGCGTTTGTAGTTCTGA-3′217p625′-TAAGTACCTGCCTGAACTCATG-3′5′-TTCTCAATTTCTACGGACAGCA-3′90

GRP78:葡萄糖调节蛋白78;CHOP:C/EBP同源蛋白;Caspase-12:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12;LC3:微管相关蛋白轻链3

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠生化指标和心脏质量指数的比较

与NC组比较,DM组小鼠血糖、血脂、心脏质量指数(心脏质量/体质量×100%)显著升高(P<0.05),血清胰岛素水平显著降低(P<0.05)。与DM组比较,低剂量组小鼠血糖、血脂、心脏质量指数显著降低(P<0.05),而血清胰岛素水平无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,高剂量组小鼠血糖、血脂、心脏质量指数显著降低,血清胰岛素水平显著升高(P<0.05)。与低剂量组比较,高剂量组小鼠血糖水平降低,血清胰岛素水平升高(P<0.05),而血脂、心脏质量指数无显著差异(P>0.05,见表2)。

表2 小鼠血糖、血脂、胰岛素和心脏质量指数比较

Table 2 Comparison of blood glucose, blood lipid, insulin and cardiac mass index in mice among four groups

组别nFPG(mmol/L) FIN (pg/ml)TC(mmol/L)TG(mmol/L)心脏质量 指数(%) NC组8 6.45±0.86798.95±107.582.28±0.600.27±0.030.41±0.01DM组819.49±2.40a383.81±38.48a4.27±0.43a0.66±0.17a0.47±0.01a低剂量组812.49±2.70ab465.00±16.50a3.54±0.13ab0.43±0.03ab0.40±0.03b高剂量组8 9.74±0.82abc579.07±46.32abc2.97±0.47ab0.33±0.03b0.43±0.02b F867.89 42.01 18.46 18.08 9.22 P8<0.001<0.001<0.001<0.0010.01

与NC组比较,aP<0.05;与DM组比较,bP<0.05;与低剂量组比较,cP<0.05

2.2 小鼠心肌组织形态学变化

心肌组织HE染色结果显示:NC组小鼠心肌纤维结构清晰,排列整齐而致密,无明显肥大、断裂表现,细胞核分布均匀呈圆形或椭圆形,细胞间质少。DM组小鼠心肌纤维肥大、肿胀明显,排列紊乱,边界不清,可见部分心肌纤维断裂及局部炎细胞浸润,细胞核大小不等,排列无序,细胞间质明显增多。低剂量组小鼠心肌纤维仍可见肥大、肿胀,但程度较DM组小鼠减轻,排列较DM组小鼠稍整齐,仍可见少量炎细胞浸润及心肌间质增多。高剂量组小鼠心肌纤维无明显肥大、肿胀、断裂,排列较整齐,未见明显炎细胞浸润,细胞核分布较均匀,心肌间质大致正常(见图1)。

A.正常对照组;B.糖尿病组;C.低剂量脂联素干预组;D.高剂量脂联素干预组图1 小鼠心肌组织HE染色结果 (×400)Figure 1 HE staining results of myocardial tissue in mice (×400)

2.3 小鼠心肌组织内质网应激指标GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA表达水平

与NC组比较,DM组小鼠心肌组织Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。与DM组比较,低剂量组小鼠心肌组织Caspase-12和GRP78 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),而CHOP mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,高剂量组小鼠心肌组织Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与低剂量组比较,高剂量组小鼠心肌组织Caspase-12、GRP78和CHOP mRNA表达水平显著降低(P<0.05,见表3)。

2.4 小鼠心肌组织自噬指标Beclin 1、LC3和p62 mRNA表达水平

与NC组比较,DM组小鼠心肌组织Beclin 1和LC3 mRNA表达水平显著降低,p62 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。与DM组比较,低剂量组小鼠心肌组织Beclin 1 mRNA表达水平显著升高,p62 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),而LC3 mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。与DM组比较,高剂量组小鼠心肌组织Beclin 1和LC3 mRNA表达水平显著增高,p62 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与低剂量组比较,高剂量组小鼠心肌组织Beclin 1和LC3 mRNA表达水平显著增高,p62 mRNA表达水平显著降低(P<0.05,见表4)。

表3 小鼠心肌组织GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA表达水平

Table 3 Comparison of GRP78, CHOP and Caspase-12 mRNA levels in myocardial tissues of mice among four groups

组别nGRP78CHOPCaspase-12NC组80.19±0.030.44±0.530.10±0.01DM组81.00±0.05a1.06±0.08a1.01±0.05a低剂量组80.53±0.04ab1.00±0.07a0.63±0.03ab高剂量组80.39±0.08abc0.75±0.01abc0.18±0.04abc F8130.2563.44442.07 P8<0.001<0.001<0.001

与NC组比较,aP<0.05;与DM组比较,bP<0.05;与低剂量组比较,cP<0.05

表4 小鼠心肌组织Beclin1、LC3、p62 mRNA表达水平

Table 4 Comparison of Beclin1, LC3 and p62 mRNA expression levels in myocardial tissues of mice among four groups

组别nBeclin 1LC3p62NC组81.00±0.091.11±0.110.26±0.01DM组80.26±0.02a0.58±0.08a1.00±0.03a低剂量组80.67±0.12ab0.70±0.04a0.86±0.03ab高剂量组80.89±0.10bc1.01±0.13bc0.71±0.08abc F842.0320.98152.23 P8<0.001<0.001<0.001

与NC组比较,aP<0.05;与DM组比较,bP<0.05;与低剂量组比较,cP<0.05

3 讨论

自噬是细胞利用溶酶体对细胞内可溶性大分子物质以及受损的细胞器进行降解、更新和再利用的过程[3,9]。研究发现,糖尿病心肌自噬功能降低,自噬功能紊乱与糖尿病性心肌病的发生、发展密切相关[3,9,10]。在自噬过程中,由自噬相关基因12(Atg12)和微管相关蛋白1轻链3(LC3)组成的两条泛素化过程将会用来修饰扩展由Bcl-2相互作用蛋白(Beclin 1)诱导形成的自噬小体,并与LC3配体-自噬适配子蛋白p62相互作用最终完成底物降解,因而检测Beclin1、LC3、p62水平能反应自噬水平的高低。本研究结果显示,糖尿病小鼠心肌组织LC3和Beclin1mRNA表达水平显著降低,p62 mRNA表达水平显著升高,提示糖尿病小鼠心肌组织自噬水平降低。糖尿病小鼠心肌细胞病理改变明显,心脏质量指数显著增大,由此我们猜测自噬水平受到抑制可能与糖尿病小鼠心肌组织受到损伤有关。研究发现,敲除脂联素的老年雄性小鼠在压力过负荷时心功能紊乱与自噬缺乏有关[10]。过表达脂联素受体1可减少高脂饮食所致肥胖小鼠心肌脂质蓄积及心肌肥厚,其机制与促进自噬有关[11]。脂联素受体激动剂通过AMPK依赖和非依赖途径恢复糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤的自噬水平,对糖尿病心肌产生保护作用[9]。脂联素是否通过调节自噬对糖尿病心肌产生保护作用,目前国内外罕见报道。本研究结果显示,脂联素干预后,低剂量组糖尿病小鼠心肌组织Beclin1 mRNA表达水平显著升高,p62 mRNA表达水平显著降低,而LC3 mRNA表达水平无明显变化;高剂量组糖尿病小鼠心肌组织LC3和Beclin1 mRNA表达水平显著升高,p62 mRNA表达水平显著降低;高剂量组效果优于低剂量组,提示脂联素可能通过激活自噬对糖尿病小鼠心肌产生保护作用,且这种保护作用具有剂量依赖性。

内质网应激是指机体在一系列病理生理因素刺激下出现内质网功能紊乱,进而激活相关信号级联反应,以应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境。研究发现,糖尿病心脏内质网应激水平增高,过强的内质网应激会对心肌组织造成一定的损伤,故而内质网应激在糖尿病心肌病变的发生和发展中起重要作用[2,12-15]。当内质网稳态异常时,应激感受蛋白与ERS分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)分离活化,促进下游内质网相关凋亡基因C/EBP同源蛋白(CHOP)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-12)等凋亡信号的表达,从而引起细胞凋亡[16,17],因而GRP78、CHOP、Caspase-12水平可反应内质网应激水平。本研究结果显示,糖尿病小鼠心脏GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA表达水平显著升高,表明糖尿病小鼠心脏内质网应激水平升高,提示糖尿病小鼠心肌受损可能与内质网应激水平升高有关。研究发现,长期缺乏自噬时,受损的细胞器和未折叠蛋白会大量积聚,从而引起内质网应激增加,导致细胞受损甚至死亡[18]。因此,本实验糖尿病小鼠心肌内质网应激水平增加可能与自噬受到抑制有关。研究发现,脂联素通过抑制内质网应激减轻缺氧/复氧、慢性间歇性缺氧和缺血再灌注对心肌细胞和心肌的损伤,对心肌细胞和心肌产生保护作用[13-15]。脂联素类似物CTRP9通过抑制内质网应激减轻心脏缺血再灌注损伤,对糖尿病大鼠心脏产生保护作用[12]。本实验研究结果显示,脂联素干预后,低剂量组糖尿病小鼠心脏GRP78和Caspase-12 mRNA表达水平显著降低,而CHOP mRNA表达水平无明显变化;高剂量组糖尿病小鼠心脏GRP78、Caspase-12和CHOP mRNA表达水平均显著降低;高剂量组效果优于低剂量组,提示脂联素可能通过抑制内质网应激对糖尿病小鼠心脏产生保护作用,这种保护作用具有剂量依赖性。研究发现,脂联素通过诱导自噬调节内质网应激减轻对乙酰氨基酚对肝细胞的损伤,对肝细胞产生保护作用[19]。本研究结果显示,脂联素干预后,糖尿病小鼠自噬水平显著升高,内质网应激水平显著降低,心脏质量指数显著降低,病理改变显著减轻,提示脂联素可能通过增强自噬进而降低内质网应激水平对糖尿病小鼠心脏产生保护作用。

综上所述,糖尿病小鼠心肌组织自噬水平降低,内应网应激水平升高,脂联素可能通过激活自噬及减轻内质网应激对糖尿病小鼠心肌组织产生保护作用。