内质网应激参与低氧诱导的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡

寇耀晖,吴 昊

(山西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室,太原 030001;*通讯作者,E-mail:kouyaohui@bjmu.edu.cn)

间充质干细胞是来源于中胚层的一种成体干细胞,具有自我更新及增殖能力。间充质干细胞易于分离且能在体外快速扩增,被广泛应用于多种疾病模型的临床前研究。但是,多项研究结果表明,间充质干细胞进入体内后,增殖能力弱,缺乏其分化成为功能性细胞的证据[1]。这可能是由于组织器官局部的低氧环境对间充质干细胞的存活造成了影响,甚至诱导凋亡。

哺乳动物细胞中主要存在三条凋亡途径[2-4],其中内质网应激作为一个重要的凋亡途径,在许多疾病的发生发展中发挥重要作用。内质网应激导致PERK、ATF6及ERE-1表达上调,激活CHOP高表达,使得CHOP表达上调成为内质网应激发生的标志信号[5]。本研究运用Chop-/-细胞进行模拟实验,以期发现内质网应激凋亡通路是否参与了间充质干细胞在低氧环境下凋亡的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6-8周C57BL/6雄鼠,购自北京大学医学部实验动物部。Chop基因缺失小鼠(B6.129S-Ddit3tm1Dron/J)购自美国JAX公司(The Jackson Laboratory)。动物实验均按照SPF级标准操作。

1.2 主要仪器及试剂

培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司;D9533试剂购自美国Sigma公司;Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术公司。流式细胞仪购自美国BD公司,荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 小鼠BmMSCs的分离、扩增

无菌条件下取出小鼠四肢长骨浸入预冷的PBS溶液,去除肌肉筋膜和骨骺,以培养基作为骨髓冲洗液,用1 ml的一次性注射器将骨髓细胞冲至细胞培养皿中。将培养皿中的混合液转移至离心管,用尖吸管轻柔地将其充分吹散后接种到新的细胞培养皿中置于37 ℃,5% CO2培养。24 h后全量换液,然后每3 d换液一次,去除未贴壁细胞,待细胞汇合度达到90%以上进行传代,即为P1代。传代后采用含15% FBS的α-MEM培养基继续培养。所有动物实验均遵循2006年国家科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》和相关伦理学规范。

1.4 流式分析BmMSCs纯度

将贴壁培养的小鼠BmMSCs以2×105/ml的密度平均分配于流式管中,分别加入4 μl FITC/PE标记的CD34、CD45、Sca-1、CD44及其相应的同型对照IgG2a、IgG2b,4 ℃避光孵育30 min。PBS洗2遍后,1 000 r/min离心5 min,向细胞沉淀中加入500 μl流式固定液,FACS流式细胞仪鉴定。

1.5 Chop+/+和Chop-/-BmMSCs的基因型鉴定

使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取小鼠基因组DNA,进行PCR反应鉴定其基因型。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 低氧、营养剥夺条件诱导细胞凋亡

用胰酶消化细胞后接种于6 mm细胞培养皿,细胞密度以贴壁后汇合度达80%为宜;全培养基过夜培养后全换液为基础培养基α-MEM加1 μmol/L D9533,置于37 ℃、氧分压5%的细胞培养孵箱培养,培养0,6,16,24 h行凋亡检测。

1.7 凋亡检测

使用Annexin Ⅴ-FITC试剂盒检测凋亡。用胰酶消化并收集贴壁细胞,细胞计数后取5×105-1×106个细胞,收集并重复洗两次,将细胞重悬于200 μl Binding Buffer,加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC轻轻混匀,避光反应15 min或4 ℃反应30 min;加入300 μl Binding Buffer(总反应体积500 μl)以及5 μl PI,在1 h内上流式细胞仪检测。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠BmMSCs的分离、培养及鉴定

提取野生型及Chop-/-基因型小鼠基因组DNA进行PCR扩增,经凝胶电泳观察Chop-/-基因型小鼠的Chop基因被截短为一个343 bp的条带,而正常Chop基因的条带位于540 bp。镜下观察小鼠骨髓间充质干细胞形态类似成纤维细胞,呈短梭形(见图1)。采用流式鉴定野生型及Chop-/-基因型小鼠BmMSCs细胞表面标志物CD34、CD45、CD44及Scal-1的表达情况。野生型小鼠BmMSCs CD34、CD45两个血系细胞表面标志物的表达率分别为0%和1.58%;间充质干细胞表面标志物CD44、Scal-1的阳性率分别达到82%及98.28%(见图2);Chop-/-基因型小鼠BmMSCs CD34、CD45表达率皆为0%,CD44、Scal-1的阳性率分别为75.74%及86.36%(见图3)。表明获得的间充质干细胞纯度较高,性质可靠,且两种基因型的间充质干细胞具有可比性。

A.基因型鉴定 B.野生型BmMSCs C. Chop-/- BmMSCs图1 WT及Chop-/-小鼠骨髓间充质干细胞基因型鉴定及形态学Figure 1 Genotping of WT and Chop deletion BmMSCs and their morphology under a microscope

图2 流式细胞术分析野生型小鼠BmMSCs表面标志物结果Figure 2 Analysis of the WT BmMSCs markers by flow cytometry

图3 流式细胞术分析Chop-/-小鼠BmMSCs表面标志物结果图Figure 3 Analysis of the Chop-/- BmMSCs markers by flow cytometry

2.2 间充质干细胞在低氧、营养剥夺条件下的凋亡情况

通过流式细胞仪检测Annexin Ⅴ阳性细胞即凋亡细胞,发现缺氧、去血清24 h后,Annexin Ⅴ阳性细胞增多,由0 h的16.76%±5.87%增加到29.51%±3.04%,差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。表明在体外缺氧、去血清的培养条件下,间充质干细胞凋亡增多。

图4 流式细胞术检测野生型小鼠BmMSCs凋亡Figure 4 Analysis of the WT BmMSCs apoptosis by flow cytometry

2.3 Chop基因缺失抑制小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

在同样体外缺氧、去血清的培养条件下,Chop基因缺失小鼠骨髓间充质干细胞凋亡减少。结果显示,缺氧、去血清24 h,Chop-/-基因型小鼠BmMSCs Annexin Ⅴ阳性细胞仅11.12%±6.22%,与同等条件下的野生型细胞(29.51%±3.04%)相比,差异有统计学意义(P<0.01,见图5)。表明Chop基因缺失可以抑制低氧、营养剥夺条件下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的发生。

图5 流式细胞术检测对比野生型及Chop-/-基因型小鼠BmMSCs凋亡Figure 5 Analysis of WT and Chop-/-BmMSCs apoptosis by flow cytometry

3 讨论

间充质干细胞是来源于中胚层的一种成体干细胞,主要存在于骨髓、脂肪、胎盘及脐带血等多种组织中,具有自我更新及增殖能力。间充质干细胞的表面标志物不具有专一性,一般不表达血细胞系的表面标志物如CD34、CD45、CD14、CD31、CD133,但表达CD29、CD105、CD166、CD54、CD55、CD13、CD44,还表达Scal-1、Stro-1、c-kit等[6,7]。间充质干细胞易于分离且能在体外快速扩增,免疫原性低且具有免疫抑制作用,同种异体移植不易引起免疫排斥反应,并具有向损伤器官组织迁移、促进组织再生的能力;在一定条件下,间充质干细胞还可以向多种组织细胞分化,但与胚胎干细胞相比,不具有成瘤性[8]。因此,作为理想的种子细胞,间充质干细胞为多种疾病的细胞移植治疗提供了更多可能。但是,真正将间充质干细胞移植应用于临床治疗的效果尚不明确,这可能与移植细胞进入损伤组织后所处的缺氧及炎性微环境影响细胞存活率有关[9]。因此,我们利用缺氧、去血清的培养条件培养细胞,发现间充质干细胞凋亡增多,表明该培养条件可以在一定程度上反映细胞进入体内后所处的微环境,细胞凋亡的发生可能与局部组织器官的缺血缺氧有关。

细胞表面死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激途径是现已知的介导哺乳动物细胞凋亡发生的主要途径[2-4]。已有研究表明,线粒体功能异常介导的细胞凋亡参与了体外低氧及血清剥夺条件下间充质干细胞的凋亡发生[10]。而内质网应激作为另一个重要的凋亡途径,在许多疾病的发生发展中发挥重要作用。其中,CHOP作为内质网应激凋亡通路上的重要转录因子,已被证实与包括神经退行性疾病、代谢性疾病、缺血性疾病及肿瘤在内的多种疾病相关。CHOP在细胞中通常低表达,但某些诱导内质网应激的促凋亡因素如营养剥夺可活化ATF4表达并促进ATF2磷酸化,激活CHOP通路进而下调Bcl-2并上调caspase-3、Bcl-X、TRB3等凋亡相关因子的表达,启动细胞凋亡的发生[11]。有研究证实,在主动脉缩窄模型中,Chop-/-小鼠心肌细胞凋亡较Chop+/+小鼠减少[12]。而在脑缺氧模型中,Chop-/-动物脑内的梗死灶较Chop+/+动物小[13]。因此,我们设计对比Chop+/+及Chop-/-小鼠骨髓间充质干细胞低氧、营养剥夺下的凋亡情况,结果证实,Chop-/-小鼠骨髓间充质干细胞凋亡减少,表明Chop基因缺失可以抑制低氧、营养剥夺条件下小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡,即CHOP高表达参与了该条件下细胞凋亡的发生,从而证实了内质网应激介导的细胞凋亡途径参与了间充质干细胞在体外低氧、饥饿条件下凋亡的发生。

综上所述,内质网应激介导的细胞凋亡在间充质干细胞低氧、饥饿条件下的凋亡发生中发挥重要作用。因此,可将内质网应激凋亡途径上相关的基因表达产物作为治疗靶点,降低移植细胞的凋亡发生,提高移植后细胞的存活数量,从而改善治疗效果。当然,移植细胞的凋亡发生还与除缺血、缺氧之外的其他环境因素有关,如局部损伤导致氧化应激发生,产生大量自由基及细胞毒性相关介质[14],还有包括线粒体功能异常在内的多条凋亡途径的共同参与[10]。因此,阐明导致间充质干细胞移植后存活率低的其他原因,还需要进行下一步的研究。